SSR荧光标记毛细管电泳分析16个博落回种质资源的遗传多样性

牛雨晴，朱育菁，郑梅霞，朱雁鸣，陈 宏，苏海兰

(福建省农业科学院作物研究所, 福建 福州 350003)

博落回Macleayacordata别名三钱三，又名筒杆、滚地龙等，为罂粟科博落回属植物[1]，多产于贵州、四川、湖南、湖北、广西、广东等地，全草有大毒，不可内服。博落回作为药用植物在抗菌抗炎、抗肿瘤、改善肝功能以及增强免疫力、治疗皮肤疾病等方面有重要功效，同时在饲料添加剂和植物源农药方面也有广泛的应用[2-6]。因此，博落回市场前景广阔且经济效益显著。但是当前，对于博落回的研究主要集中在化学成分、药理作用、抗癌药物及生物农药等方面，而对博落回植物遗传多样性与品种选育研究相对缺乏[7-11]。博落回育种工作进展缓慢，对其育种工作缺乏系统深入研究，生产上容易出现种质混杂以及种性退化，严重影响该产业的健康、可持续发展。

分子标记因具有高特异、高精度、微量、快速等特点，可从DNA层面上直接识别出不同种质之间的差异，是研究药材种质资源遗传多样性的重要方法。近年来，科研人员已将各种分子标记技术应用在药用植物遗传多样性、种质资源的鉴定和辅助育种等研究领域[13]，但博落回中DNA分子标记研究较少。黄鹏等[14]对来自湖南、江西等地的30个博落回属植物ITS2序列进行扩增和测序，并获得30条博落回ITS2序列，这些ITS2序列可以有效准确鉴别博落回属植物。朱鹏程等[15]基于博落回转录组测序数据设计并筛选了28对SSR有效性引物，利用引物扩增发现4个产地博落回的相似性较高。然而，过去研究中所使用的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，灵敏性、准确性及效率相比荧光标记毛细管技术更低。利用SSR荧光标记毛细管技术用于多个省份博落回种质资源遗传多样性的研究尚未见报道。本研究基于文献报道的SSR分子标记，对贵州、江西、福建、湖南、湖北及浙江等13个省份16份博落回种质资源遗传多样性及亲缘关系进行了综合分析，为博落回种质资源鉴定提供参考依据，并对进一步利用分子标记缩短育种年限有现实意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

16份博落回种质资源来自我国13个省份，所有种质材料均由福建省农业科学院农业生态研究所陈敏健副研究员鉴定，具体信息见表 1。

1.2 仪器和试剂

磁珠法基因组DNA提取试剂盒(武汉纳磁生物科技有限公司)；2×TaqPCRMasterMix(美国基因泰克公司)；384孔PCR板[爱思进生物技术(杭州)有限公司]；分子量内标GeneScanTM500 LIZ、Hi-DiTMFormamide、POP-7TMPolymer、3730 Running Buffer(10X)(赛默飞世尔科技公司)。

1.3 试验方法

1.3.1DNA的提取 采用磁珠法植物基因组提取试剂盒配套说明书对博落回样本进行核酸提取。取适量植物组织(鲜重20～50 mg)在液氮中研磨后，经过DNA沉淀、DNA清洗、DNA溶解去杂，最终得到每份博落回样品的DNA。经过凝胶核酸电泳检测成功后的DNA进行吸光度值的检测后，置于-20℃保存备用。

1.3.2荧光PCR扩增 SSR引物采用朱鹏程等[15]开发的引物，共6对，引物信息见表2。16份种质资源样本扩增反应在Veriti384 PCR仪上进行。PCR扩增程序设置为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，62～52℃梯度退火30 s，72℃延伸30 s，运行10个循环；95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，运行25个循环；72℃延伸20 min，最后4℃保存。PCR反应结束后，扩增产物经荧光毛细管电泳检测。

表2 6对SSR引物信息

1.3.3毛细管电泳检测 取PCR产物1 μL、分子量内标0.5 μL和去离子甲酰胺8.5 μL混合加入PCR板离心后放到PCR仪上运行变性程序(95℃、3 min)，变性完成后立即冷却。在ABI3730XL DNA遗传分析仪上进行毛细管电泳，并用Data Collection软件收集电泳原始数据。

1.3.4数据分析 收集到的原始数据利用Genemapper软件分析，计算扩增片段大小。按照毛细管电泳迁移位置，用1和0分别代表检测到扩增片段的有无，建立原始数据表。利用POPGENE 1.32 软件统计观测等位基因数(Na)、Shannon′s信息指数(I)、有效等位基因数(Ne)，利用NTSYS 2.10e软件对各品种进行遗传相似性分析，采用UPGMA(unweighted pair group method with average)法对各品种进行聚类分析，利用PIC-CAL计算多态信息含量(PIC)。利用R包poppr的aboot方法，UPGMA方法进行聚类分析。

1.3.5指纹图谱构建 根据检测到的引物等位基因差异，建立16份博落回种质资源样品的指纹图谱，并对6对标记的扩增片段按分子量大小排列，并进行数字编码。

2 结果与分析

2.1 SSR标记的多态性分析

由表3可知，6对SSR引物在16个博落回种质资源中检测到27个等位基因，等位基因数(Na)的变化幅度为2～6个，平均为4.5个，说明这些引物可适于16份博落回种质资源的遗传多样性检测；有效等位基因数(Ne)的变化幅度为2～3.686，平均为2.6105，其中有效等位基因数最高的是P1，为3.686，其次是P5、P37和P24，分别为2.82、2.56和2.513，说明这4对引物有较高的检测效率；Shannon′s指数(I)的变化幅度为0.693～1.479，平均为1.1098；多态信息含量(PIC)的变化范围为0.375～0.687，平均为0.5355，PIC大于0.50的位点为高度多态位点，在0.25～0.50为中度多态位点，小于0.25时为低度多态位点[15]，说明16份博落回种质资源属于高度多态位点，具有一定的遗传变异。

表3 6对SSR标记对16份博落回种质资源的多态性分析

2.2 遗传相似系数分析

由表4可知，16份博落回种质资源的遗传相似系数为0.0714～0.7142，平均值为0.5790，其中云南(N)与陕西(I)遗传相似系数最小，为0.0714，说明这两份资源之间遗传基础差异最大，亲缘关系最远；江苏(K)与甘肃(J)这两样本之间的遗传相似性系数最大，为0.7142，说明这两份资源间遗传基础差异最小，亲缘关系最近。

表4 16份博落回种质资源的遗传相似系数

2.3 聚类分析

由图1可知，在遗传相似系数0.3处可将16份博落回种质资源分为3个大类群，第Ⅰ大类包括三明明溪(A)、云南(N)、长沙(B)、贵州独山县(C)、贵州罗甸县(D)、贵州边阳县(E)、重庆(O)，说明这7份种质资源具有相近的遗传背景，与其他种质资源遗传关系较远；第Ⅱ大类只有三明明溪(P)这一份种质资源；其余8份种质资源聚到第Ⅲ大类。进一步遗传分析表明，第Ⅰ大类在遗传相似系数0.5处又可分为3个亚类，第ⅰ亚类有三明明溪(A)、云南(N)2份种质资源；第ⅱ亚类有长沙(B)、贵州独山县(C)、贵州罗甸县(D)、贵州边阳县(E)4份种质资源；第ⅲ亚类只有重庆(O)这1份种质资源。第Ⅲ大类在遗传相似系数0.5处又可分为2个亚类，第ⅰ亚类有浙江(F)、甘肃(J)、江苏(K)、云南(N)4份种质资源。

2.4 SSR指纹图谱的构建

按表5顺序将6对标记对应的编码组合，每份种质资源可得到唯一的数字编码，组成每份种质资源的DNA指纹图谱(表6)。如样本“P”中的扩增片段大小为184、212、197、237、216、186、183、225/227，转换成0，1格式的指纹数字代码为010100001000100000001000110。首先，按照引物P12、P1、P24、P37、P5、P9的顺序进行排序；然后，在每个位点中，根据所有样本的扩增产物大小依次进行排序，如P37位点在所有样本中的扩增产物大小为：235、237、250、253、256 bp，样本P在这个位点的扩增片段大小为237/237，转化成0，1格式即为01000；依次类推，将样本在每个位点中的0，1矩阵按位点顺序排列组成在一起即为该样本的0，1指纹图谱。

表5 6个标记的多态性片段及其编码

表6 16份博落回种质资源指纹图谱

3 讨论与结论

本研究表明在16份博落回的供试材料中，引物P1扩增条带中的213、219 bp，引物P9扩增条带中的218、227 bp，这些条带是福建三明明溪(优)产地特有的条带；引物P1扩增条带中的212 bp，引物P9扩增条带中的225、227 bp，这些条带是福建三明明溪(一般)产地特有的条带；引物P5扩增条带中的189、191 bp是甘肃产地博落回所特有的条带；引物P9扩增条带中的211、230 bp，引物P24扩增条带中的206 bp，引物P37扩增条带中的235、237 bp，这些条带是重庆产地特有的条带；引物P24扩增条带中的209 bp条带是长沙山上博落回所特有的条带。这些条带将为博落回的产地溯源及种质资源评价提供帮助。

已有的植物SSR分子标记遗传多样性研究中，SSR扩增产物主要由聚丙烯酰胺凝胶电泳检测[16-17]，较难准确读出扩增片段大小，并且整合不同试验批次和不同胶板的数据是个难题，容易出现人为的误读或错读。SSR荧光标记毛细管电泳检测可直接读出扩增的目标片段大小，检测数据更为准确[18]，便于遗传多样性分析数据整合及分析。本研究区别于其他研究中所利用的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，利用SSR荧光标记毛细管电泳检测准确地对16份博落回种质资源进行遗传多样性分析，发现供试种间的遗传相似系数0.0714～0.7142，平均值为0.5790，说明16份博落回种质资源遗传多样性丰富。这一结果的遗传相似系数范围相比于其他研究结果更广，这可能是因为本研究所用的试供材料来源范围更广，说明本研究的结果对博落回种质资源遗传多样性的分析具有重要意义。

在16份来自不同省份的博落回样品中，亲缘关系最近的为甘肃(J)种质与江苏(K)种质，说明它们之间的遗传差异很小；采自云南(N)种质与陕西(I)种质之间的亲缘关系最远。而来自福建三明明溪的两个不同种质其遗传相似系数为0.2727，遗传相似系数较低。从遗传相似系数看种质亲缘关系，福建三明明溪的两个不同种质的遗传相似系数小于甘肃(J)种质与江苏(K)种质之间的遗传相似系数，这表明博落回种质资源间亲缘关系的远近不全由地理距离决定，其种质资源之间的基因交流可能还与地形地貌、生态气候、海拔经纬度、生物群落分布等自然因素及人类活动等社会因素密切相关，从而影响种质之间的亲缘关系。16份来自于不同省份的博落回样品在阈值为0.3时分为三大类，这些样品遗传多样性处于较高水平，其种质资源基因库较为丰富，种质间有明显分化，有待于结合生物学特性、农艺性状、化学成分及其他分子标记技术进一步探讨研究。