二氢杨梅素通过JAK2/STAT3 通路调控小胶质细胞活化对异氟醚所致成年小鼠早期认知功能障碍的影响

刘 伟 方 军 张抗抗 （滕州市中心人民医院麻醉科，滕州 277599）

异氟醚作为常用的吸入式麻醉剂，可通过诱导认知功能障碍相关的神经毒性或降低海马乙酰胆碱水平引发术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）［1］。POCD 的主要特征为患者在麻醉或手术后出现认知功能障碍，表现为思维、注意力、记忆等认知功能改变，提高患者的住院时间及病死率，其病理生理学机制至今仍然未知，因此有必要对异氟醚所致POCD 的发生及治疗机制进行深入探究［2-3］。有研究发现，小胶质细胞活化介导的中枢神经炎症是POCD 发生的主要原因之一，因此有效抑制小胶质细胞活化可能对POCD 的治疗具有重要意义［4］。二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）具有抗炎及神经保护作用，已被多项研究证实可改善认知和运动能力，研究发现其在丙泊酚诱导的认知功能障碍大鼠中可通过调节小胶质细胞极化改善认知功能障碍［4-5］。蛋白酪氨酸激酶2/信号 转 导 和 转 录 活 化 因 子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）通路是调控小胶质细胞活化的关键通路，抑制其激活可减轻小胶质细胞活化诱发的炎症反应［6］。有报道称，DMY 可通过抑制JAK2/STAT3 通路改善脂多糖诱导的小胶质细胞炎症反应，但DMY是否可通过调控JAK2/STAT3 通路改善POCD 还未可知［7］。因此，本研究使用异氟醚处理小鼠，探究DMY 通过JAK2/STAT3通路调控小胶质细胞活化对异氟醚所致成年小鼠早期认知功能障碍的影响，以期为DMY在POCD中的治疗机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 50 只SPF 级雄性C57BL/6 小鼠（20～25 g）购自南方医科大学，许可证号：SCXK（粤）2016-0041，12 h/12 h 明暗交替、室内环境温度（25±10） ℃，通风饲养7 d。

1.1.2 主要试剂与仪器 二氢杨梅素（YG10356，上海韵泰信息科技有限公司）；免疫组化试剂盒（PK-7800，北京博蕾德生物科技有限公司）；BCA 试剂盒、蛋白提取试剂盒（LCB004、MB2820，上海榕柏生物技术有限公司）；兔抗CD68 抗体（bs-0649R-2，上海恒斐生物科技有限公司）；HRP-IgG 抗体、兔抗精 氨 酸 酶（Arginase）、β-actin、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、兔抗离子钙结合衔接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）抗体（7074、93668、4970、4904、9145、3230、3771、13120、17198，Cell Signaling Technology）；IL-10、IL-1β 试剂盒（C9264、C9278，上海名劲生物科技有限公司）。GenoSens 2200 Touch 凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；LONZA ELx808 酶标仪（北京泽平科技有限责任公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型构建 将50 只C57BL/6 小鼠随机分为对照组（10只）和模型组（40只）。模型构建：将小鼠置于铺有薄层钙石灰的40 cm×35 cm×30 cm麻醉箱中，持续4 h 输入异氟醚（1.4%，4 L/min），4 h后小鼠仰卧或侧卧时间若超出60 s 即翻正反射消失，则造模成功［8］，成功率为100%；对照组小鼠不进行任何处理；造模成功后次日，将模型组小鼠以10只/组分为异氟醚组、DMY-L组（100 mg/kg DMY）、DMY-H 组（200 mg/kg DMY）、DMY-H+AG490 组（200 mg/kg DMY+JAK2抑制剂AG490 0.4 mg/kg）［4，9］。DMY-L 组、DMY-H 组、DMY-H+AG490 组小鼠灌胃相应剂量DMY 或AG490，对照组、异氟醚组灌胃等量生理盐水，为时1周（1次/d）。

1.2.2 大鼠行为学观察

1.2.2.1 旷场实验 处理结束后次日，将小鼠置于观察箱（100 cm×100 cm）中，通过Smart 系统记录5 min内其运动路程及站立次数，以评估小鼠自主活动能力；每只小鼠实验结束后使用75%乙醇擦去观察箱残留气味，避免干扰后续实验。

1.2.2.2 新旧事物识别 记录5 min 内小鼠对新旧物体的探索次数，指标越高表示其记忆能力越好。

1.2.2.3 水迷宫实验 将自制的水迷宫水池（直径：150 cm，高：50 cm，水深：25 cm）均等划分为4 个象限，于距第一象限池壁35 cm处放置1个距离水面3 cm 的黑色圆形平台（高：22 cm，直径：12 cm），于第三象限将小鼠放入水中，引导至平台停留20 s 后推入水中，再次寻找平台，进行为时5 d 的训练（4 次/d），全程使用计算机摄像系统观察其运动轨迹，第6天移去平台，记录小鼠穿越平台次数及进入水中至到达平台的时间（逃避潜伏期），以评估其认知功能。

1.2.3 免疫组化法测定海马组织Iba1 表达 行为学测试结束后每组选取5 只小鼠取其脑组织，分离海马组织于多聚甲醛中过夜固定，常规石蜡包埋后进行连续切片（4 µm），使用过氧化氢孵育（10 min），消除内源性过氧化物酶，抗原修复后孵育血清进行封闭，0.5 h 后Iba1 一抗过夜孵育，次日使用生物素标记的二抗孵育（20 min），DAB显色后脱水透明，进行封片，通过Image Pro Plus 6.0 观察Iba1 棕黄色阳性细胞并计数（×400）。

1.2.4 ELISA 检测小鼠海马组织IL-10、IL-1β 水平 取剩余小鼠脑组织，剥离海马组织，12 500 r/min离心20 min 后取其匀浆上清液，一部分根据IL-10、IL-1β ELISA 试剂盒于450 nm 处测定二者水平（n=5），剩余部分上清液进行Western blot实验。

1.2.5 Western blot 检测海马组织CD68、iNOS、精氨酸酶蛋白及JAK2/STAT3 通路蛋白表达 从1.2.4 蛋白上清液中提取总蛋白，BCA 法检测其浓度后取蛋白样品进行100 ℃沸水浴变性（10 min），冷却后以40 µg/孔进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，切下目的条带于低温下转至PVDF 膜，5%牛血清白蛋白 封 闭2 h，一 抗（兔 抗CD68、iNOS、Arginase、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2、β-actin抗体，1∶1 000）过夜孵育后，山羊抗兔HRP-IgG 二抗（1∶5 000）孵育1 h，滴加ECL 化学液显影，蛋白凝胶成像仪成像，Image J 分析条带灰度后计算CD68、iNOS、精氨酸酶、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2蛋白水平（n=5）。

1.3 统计学方法 SPSS23.0 软件分析实验所得数据后用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间数据两两比较采用LSD 检验；P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DMY 对小鼠自主活动及新旧事物识别能力的影响 与对照组相比，异氟醚组小鼠站立次数及运动路程显著减少（P＜0.05）；与异氟醚组相比，DMYL 组、DMY-H 组小鼠站立次数及运动路程显著增加（P＜0.05）；与DMY-L 组相比，DMY-H 组小鼠站立次数及运动路程显著增加（P＜0.05）；与DMY-H 组相比，DMY-H+AG490 组站立次数及运动路程显著增加（P＜0.05），见表1。

表1 DMY 对小鼠自主活动及新旧事物识别能力的影响（±s，n=10）Tab.1 Effects of DMY on autonomous activity and recognition ability of new and old things in mice （±s，n=10）

表1 DMY 对小鼠自主活动及新旧事物识别能力的影响（±s，n=10）Tab.1 Effects of DMY on autonomous activity and recognition ability of new and old things in mice （±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3） P＜0.05； compared with DMY-H group， 4） P＜0.05.

Standing times/time 67.20±8.33 43.08±4.301）50.40±5.052）57.63±4.122）3）64.90±5.244）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 Movement distance/cm 2 120.35±225.40 864.12±109.821）1 226.70±122.172）1 673.12±140.392）3）2 070.85±153.224）

2.2 DMY 对小鼠认知功能的影响 与对照组相比，异氟醚组小鼠穿越平台次数显著减少，逃避潜伏期显著增加（P＜0.05）；与异氟醚组相比，DMY-L组、DMY-H 组小鼠穿越平台次数显著增加，逃避潜伏期显著减少（P＜0.05）；与DMY-L 组相比，DMY-H组小鼠穿越平台次数显著增加，逃避潜伏期显著减少（P＜0.05）；与DMY-H 组相比，DMY-H+AG490 组穿越平台次数显著增加，逃避潜伏期显著减少（P＜0.05），见表2。

表2 DMY对小鼠认知功能的影响（±s，n=10）Tab.2 Effects of DMY on cognitive function in mice（±s，n=10）

表2 DMY对小鼠认知功能的影响（±s，n=10）Tab.2 Effects of DMY on cognitive function in mice（±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3） P＜0.05； compared with DMY-H group， 4） P＜0.05.

Escape latency/s 14.10±1.12 27.86±2.501）22.73±1.372）18.66±1.112）3）15.40±1.204）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 Times of crossing platform/time 8.93±1.02 2.01±0.571）4.80±0.612）6.61±0.752）3）8.70±0.634）

2.3 DMY 对小鼠海马组织Iba1表达的影响 与对照组相比，异氟醚组小鼠海马组织Iba1 阳性细胞数显著增加（P＜0.05）；与异氟醚组相比，DMY-L 组、DMY-H 组Iba1 阳性细胞数显著减少（P＜0.05）；与DMY-L组相比，DMY-H组Iba1阳性细胞数显著减少（P＜0.05）；与DMY-H组相比，DMY-H+AG490组Iba1阳性细胞数显著减少（P＜0.05），见表3、图1。

图1 DMY对小鼠海马组织Iba1表达的影响（×200）Fig.1 Effect of DMY on Iba1 expression in mouse hippocampus （×200）

表3 DMY对小鼠海马组织Iba1表达的影响（±s，n=5）Tab.3 Effect of DMY on Iba1 expression in mouse hippocampus （±s，n=5）

表3 DMY对小鼠海马组织Iba1表达的影响（±s，n=5）Tab.3 Effect of DMY on Iba1 expression in mouse hippocampus （±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3） P＜0.05； compared with DMY-H group， 4） P＜0.05.

Number of positive cells/individual 7.82±1.33 98.40±8.271）65.24±6.392）40.52±5.032）3）19.06±3.274）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490

2.4 DMY 对小鼠海马组织IL-10、IL-1β 水平的影响 与对照组相比，异氟醚组小鼠海马组织IL-10水平显著降低，IL-1β 水平显著升高（P＜0.05）；与异氟醚组相比，DMY-L组、DMY-H组IL-10水平显著升高，IL-1β 水平显著降低（P＜0.05）；与DMY-L 组相比，DMY-H 组IL-10 水平显著升高，IL-1β 水平显著降低（P＜0.05）；与DMY-H 组相比，DMY-H+AG490组IL-10 水平显著升高，IL-1β 水平显著降低（P＜0.05），见表4。

表4 DMY 对小鼠海马组织IL-10、IL-1β 水平的影响（±s，n=5）Tab.4 Effect of DMY on levels of IL-10 and IL-1β in hippocampus of mouse （±s，n=5）

表4 DMY 对小鼠海马组织IL-10、IL-1β 水平的影响（±s，n=5）Tab.4 Effect of DMY on levels of IL-10 and IL-1β in hippocampus of mouse （±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3）P＜0.05； compared with DMY-H group， 4）P＜0.05.

IL-10/（µg·L-1）22.77±2.30 10.34±0.981）13.90±1.032）17.92±1.522）3）21.74±2.104）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 IL-1β/（µg·L-1）5.65±0.61 11.51±0.891）9.58±0.462）7.18±0.442）3）6.03±0.384）

2.5 DMY 对小鼠海马组织CD68、iNOS、精氨酸酶表达的影响 与对照组相比，异氟醚组小鼠海马组织精氨酸酶表达显著减少，CD68、iNOS 表达显著增加（P＜0.05）；与异氟醚组相比，DMY-L 组、DMY-H组精氨酸酶表达显著增加，CD68、iNOS 表达显著减少（P＜0.05）；与DMY-L 组相比，DMY-H 组精氨酸酶表达显著增加，CD68、iNOS 表达显著减少（P＜0.05）；与DMY-H 组相比，DMY-H+AG490 组精氨酸酶表达显著增加，CD68、iNOS 表达显著减少（P＜0.05），见表5、图2。

图2 DMY 对小鼠海马组织CD68、iNOS、精氨酸酶表达的影响Fig.2 Effect of DMY on expressions of CD68， iNOS and Arginase in mouse hippocampus

表5 DMY 对小鼠海马组织CD68、iNOS、Arginase 表达的影响（±s，n=5）Tab.5 Effect of DMY on expressions of CD68， iNOS and Arginase in mouse hippocampus （±s， n=5）

表5 DMY 对小鼠海马组织CD68、iNOS、Arginase 表达的影响（±s，n=5）Tab.5 Effect of DMY on expressions of CD68， iNOS and Arginase in mouse hippocampus （±s， n=5）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3） P＜0.05； compared with DMY-H group， 4） P＜0.05.

CD68/β-actin 0.65±0.08 1.73±0.221）1.36±0.152）1.01±0.102）3）0.74±0.084）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 iNOS/β-actin 0.41±0.06 1.60±0.201）1.19±0.142）0.87±0.092）3）0.60±0.064）Arginase/β-actin 1.83±0.31 0.40±0.071）0.71±0.102）1.12±0.132）3）1.63±0.234）

2.6 DMY 对小鼠海马组织JAK2/STAT3 通路蛋白表达的影响 与对照组相比，异氟醚组小鼠海马组织p-STAT3/STAT3 及p-JAK2/JAK2 表达显著增加（P＜0.05）；与异氟醚组相比，DMY-L 组、DMY-H 组p-STAT3/STAT3 及p-JAK2/JAK2 表达显著减少（P＜0.05）；与DMY-L 组相比，DMY-H 组p-STAT3/STAT3及p-JAK2/JAK2 表达显著减少（P＜0.05）；与DMY-H组 相 比，DMY-H+AG490 组p-STAT3/STAT3 及p-JAK2/JAK2表达显著减少（P＜0.05），见表6、图3。

图3 DMY 对小鼠海马组织JAK2/STAT3 通路蛋白表达的影响Fig.3 Effect of DMY on JAK2/STAT3 pathway protein expression in mouse hippocampus

表6 DMY 对小鼠海马组织JAK2/STAT3 通路蛋白表达的影响（±s，n=5）Tab.6 Effect of DMY on JAK2/STAT3 pathway protein expression in mouse hippocampus （±s，n=5）

表6 DMY 对小鼠海马组织JAK2/STAT3 通路蛋白表达的影响（±s，n=5）Tab.6 Effect of DMY on JAK2/STAT3 pathway protein expression in mouse hippocampus （±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3）P＜0.05； compared with DMY-H group， 4）P＜0.05.

p-JAK2/JAK2 0.53±0.06 1.88±0.281）1.38±0.172）0.71±0.102）3）0.30±0.09 Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 p-STAT3/STAT3 0.39±0.05 1.62±0.211）1.20±0.152）0.89±0.102）3）0.54±0.074）

3 讨论

大量研究表明，吸入性麻醉剂异氟醚可通过浓度及时间依赖性方式影响动物的学习和记忆能力［1，8］。POCD是一种手术并发症，研究发现，由麻醉引发的神经炎症是POCD 发生的主要原因［10-11］。小胶质细胞作为中枢神经系统的重要免疫细胞，在正常状态下处于非活化状态，一旦受到炎症刺激就会被显著激活，进一步促进炎症因子表达，扩大炎症反应，导致POCD［10］。因此，本研究通过使小鼠吸入异氟醚成功构建异氟醚麻醉模型，以探究有效抑制小胶质细胞活化对异氟醚所致POCD治疗的影响。

小胶质细胞在炎症状态下可分化为M1型及M2型，M1 型小胶质细胞可促进IL-1β 等炎症因子表达，而M2 型 则 促 进IL-10 等 抗 炎 因 子 表 达［10-12］。DMY 可穿过血脑屏障，调节炎症反应，发挥神经保护功效，有报道称，DMY 在APP/PS1 转基因小鼠中可通过抑制小胶质细胞激活起到神经保护作用［13］。DMY 可通过激活AMP 依赖的蛋白激酶［adenosine 5'-monophosphate （AMP）-activated protein kinase，AMPK］途径抑制炎症、氧化应激及细胞凋亡，从而改善铅诱导的小鼠认知功能障碍［14］。还有研究表明，DMY 可通过促进小胶质细胞M1向M2型转化改善丙泊酚诱导的大鼠认知功能障碍［4］。本研究结果表明，DMY 可有效改善异氟醚所致成年小鼠运动、记忆等认知功能障碍。M1型和M2型小胶质细胞的标志分子分别为iNOS 和精氨酸酶［4］。CD68 作为一种溶酶体蛋白，是活化的小胶质细胞标志物，在细胞活化后表达显著增加［15］。本研究还发现，与异氟醚组相比，DMY 可显著增加IL-10 及精氨酸酶表达，减少小胶质细胞标志物Iba1 阳性细胞数及IL-1β、CD68、iNOS 表达，表明DMY 可有效抑制小胶质细胞活化，并促进其由M1 型向M2 型转化，减轻炎症损伤。

多项研究表明JAK2/STAT3 参与小胶质细胞的活化［6，16］。STAT3 在小胶质细胞对各种刺激的应答中具有重要调节作用，其激活可促进促炎因子表达［17］。Kappa 阿 片 受 体 激 动 剂 通 过 抑 制JAK2/STAT3 通路改善大鼠体外循环POCD［18］。伐尼克兰通过抑制JAK2/STAT3通路减少老年雄性C57BL/6N小鼠剖腹手术后的神经炎症反应、DNA 损伤及术后认 知 障 碍［19］。高 迁 移 率 族 蛋 白B1（high mobility group protein box 1，HMGB1）分泌到胞外可刺激炎症介质释放，加剧炎症反应，而DMY 可通过抑制JAK2/STAT3 通路抑制脂多糖诱导的小胶质细胞HMGB1 释放，从而抑制炎症反应［20］。本研究发现，DMY 可有效抑制异氟醚所致成年小鼠海马组织JAK2/STAT3通路激活，还发现STAT3抑制剂AG490可进一步增强DMY 对异氟醚所致成年小鼠认知功能障碍的改善作用，该结果表明，DMY 对异氟醚所致成年小鼠认知功能障碍的改善可能与其抑制JAK2/STAT3通路激活有关。

综上所述，DMY 可能通过抑制JAK2/STAT3 通路抑制小胶质细胞活化，促进其M1/M2 型转化，从而改善异氟醚所致成年小鼠早期认知功能障碍。本研究不仅为DMY 在POCD 中的治疗机制研究提供参考，还为POCD 治疗新型药物的探究提供了方向。但由于模型数量限制，本研究未对DMY 在POCD 中的其他可能机制进行探究，课题组将在未来的研究中进一步补充。