基因工程改造巨噬细胞及其应用①

鲍佳明 赵晨旭 孙凌云 赵 勇 （中国科学院动物研究所膜生物学国家重点实验室，北京 100101）

巨噬细胞是一类专职的吞噬细胞和抗原递呈细胞，是免疫系统的重要组成，广泛参与病原体清除、炎症反应介导、组织微环境稳态维持和修复等过程。巨噬细胞与人类许多疾病密切相关，包括癌症、自身免疫病等［1］。此外，巨噬细胞也与移植物排斥反应相关［2］。因此，以巨噬细胞为靶点的疾病治疗策略具有巨大应用潜力。巨噬细胞的基因工程改造手段受到广泛关注。转导技术作为改造细胞的一种重要手段广泛用于科研和临床。但巨噬细胞作为一种天然免疫细胞，一方面其胞内有多种核酸酶和蛋白酶，能够破坏外源核酸和蛋白结构；另一方面在受到抗原或细胞因子刺激后迅速活化与极化，给巨噬细胞基因工程改造带来挑战。此外，由于巨噬细胞是终末分化细胞，几乎不能进行增殖。因此巨噬细胞改造时保证细胞活性十分重要。本文简要介绍目前常用的几种巨噬细胞基因工程改造方法，并分析其优缺点，展望基因工程改造巨噬细胞在治疗肿瘤、自身免疫病等疾病和抗移植物排斥反应方面的应用前景。

1 巨噬细胞改造方法

目前常用的巨噬细胞基因工程改造方法包括脂质体转染法、电转染法、腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）转导法、慢病毒（lentivirus，LV）转导法和生物材料法，各种改造方法均存在其优缺点，以下进行简要介绍（表1）。

表1 巨噬细胞改造方法及其优缺点Tab.1 Methods of macrophage editing and their advantages and disadvantages

1.1 脂质体转染法 将外源核酸片段通过主动或被动方式导入宿主细胞的过程称为转染。脂质体转染法是利用带正电荷的阳离子人工双层膜结构通过静电作用包裹带负电荷的核酸从而形成脂质体，再通过膜融合方式将外源核酸序列传递到细胞中，从而实现细胞改造。与病毒转导或电转染法相比，脂质体转染具有操作简便、成本低、安全性高和细胞毒性小等特点。但巨噬细胞对脂质体转染不敏感，难以使用脂质体对其进行转染［3］。主要原因为：①巨噬细胞膜上含有大量糖蛋白，不利于膜融合；②巨噬细胞内含有核酸酶，易破坏外源核酸片段，此外，受到外源核酸刺激后，巨噬细胞会迅速活化，导致巨噬细胞状态发生变化；③巨噬细胞作为终末分化细胞，几乎不能增殖，导致巨噬细胞核膜完整性高，外源核酸片段很难入核进行复制、转录［4］。

目前针对脂质体转染巨噬细胞效率低下这一技术瓶颈，研究人员从不同角度对脂质体转染进行了优化。凋亡细胞会产生一类被称为凋亡小体（apoBD）的囊泡，巨噬细胞能够识别这类囊泡并以胞吞形式将apoBD 摄入细胞。根据这一特点，LAI等［3］通过在脂质体中加入Ca2+和1，2，二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸（DOPS）模拟apoBD 结构，借此增加巨噬细胞对脂质体的主动摄取。但脂质体大多带正电荷，大剂量脂质体转染会产生很强的细胞毒性。NOGUEIRA 等［5］在脂质体中掺入中性二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）缓解阳离子脂质体的细胞毒性作用，在体内实现巨噬细胞MCL1基因沉默。随着脂质体转染条件不断优化，脂质体作为一种新型的生物材料在靶向编辑巨噬细胞方面将发挥重要作用，这部分内容将在后续生物材料章节中进行介绍。

1.2 电转染法 电转染又称电穿孔，指细胞膜在强电脉冲作用下形成小孔，亲水性核酸、蛋白等分子通过这一小孔进入细胞的过程［6］。随后这些小孔重新关闭维持细胞膜结构完整性［7］。当附加电场刺激超过阈值时，细胞膜结构无法恢复，导致细胞死亡。电场阈值与细胞大小等多因素相关，而细胞形态、大小、结构、状态具有高度不均一性，这就解释了为什么电转染的细胞毒性较大，易造成细胞大量死亡。值得重视的是，巨噬细胞作为终末分化细胞，几乎无法进行增殖，巨噬细胞改造时需更加关注细胞活性状态。单核细胞作为巨噬细胞前体，能够有效诱导发育为巨噬细胞，且单核细胞具有一定增殖能力，因此研究人员将目光转移到单核细胞基因编辑上。目前已通过优化电转程序成功实现了对单核/巨噬细胞系（RAW264.7、THP-1）和骨髓来源单核/巨噬细胞的基因编辑，且转染效率达90%以上，存活率达70%以上［8］。需要注意的是，单核/巨噬细胞电转染死亡率与转染的核酸片段大小有关［9］。电转染后，骨髓来源单核/巨噬细胞激活标志物上调，说明电转染在一定程度导致原代单核/巨噬细胞激活［8］。如何根据需要有效调控巨噬细胞激活可能是未来电转染改造巨噬细胞的发展目标之一。

尽管电转染法存在高细胞毒性的弊端，但与脂质体转染相比，电转染有极高的转染效率及更高的基因整合率。电转染能够打开巨噬细胞核膜，从而增加外源核酸片段进入细胞核内的机会，提高编辑效率。脂质体转染和电转染法不适合需要持续表达外源基因的巨噬细胞改造，因为随机整合是一个低概率事件，难以筛选出稳定表达外源基因的巨噬细胞群体，而游离于基因组外的核酸片段会发生失活、水解或丢失［10］。使用AAV 和LV 转导技术改造巨噬细胞并持续表达外源基因是更优选择。

1.3 AAV 转导法 转导指通过病毒将一个宿主DNA 转移到另一个宿主细胞引起基因重组的现象。AAV是一类结构简单的单链DNA细小病毒，基因组大小约为4.7 kb，为复制缺陷型，需要辅助病毒（通常为腺病毒）存在才能复制。AAV 具有强大的基因传递能力、较高的安全性和缺乏致病性等优点，已作为临床最有潜力的病毒载体受到关注。不同AAV 亚型由于受体不同，具有不同组织偏好性，能够感染特定的组织细胞，如AAV2 能够以硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）、人类成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）等作为受体，几乎能够感染人体所有细胞［11］。而AAV8 能够识别层黏连蛋白受体，靶向感染肝脏细胞［12］。这种不同亚型病毒的不同组织偏好性无疑给AAV带来了更高的应用潜力。

限制AAV 应用的原因之一是AAV 仍具有一定免疫原性（虽然免疫原性低于LV），引起人体免疫应答，导致病毒很快被清除，使用AAV 对巨噬细胞进行改造时尤其如此。巨噬细胞膜上的TLR2 能够识别AAV 衣壳蛋白结构；而巨噬细胞胞内的TLR9 能够识别AAV 核酸的CpG 区［13］。这些因素导致使用AAV 转导巨噬细胞的效率降低或巨噬细胞活化或极化。研究发现，在AAV 基因组中加入1 个24 bp的含有4个CpG 区域的高度炎症性寡脱氧核糖核苷酸（ODN）能够有效降低TLR9 活性，原因可能为ODN 竞争性与TLR9 结合，导致巨噬细胞TLR9 处于“无应答”状态，从而降低巨噬细胞对AAV 的免疫应答［14］。通过对AAV 衣壳蛋白三重对称轴附近的碱基进行点突变能够降低AAV 衣壳蛋白免疫原性，但过多的点突变可能导致衣壳蛋白无法正确 折叠［15］。第二，由于AAV病毒结构简单，导致AAV 能够接入的外源片段较短（不能大于4.5 kb）［16］。第三，不同于慢病毒，AAV 基因组主要以附加体形式存在于宿主细胞核，不易整合进入细胞基因组，导致AAV 在转导分裂旺盛的细胞时易造成外源基因丢失［17］。最后，由于AAV 基因组是单链的，但转导靶细胞后，病毒基因组必须首先转换为具有转录活性的双链形式，这是AAV 载体转基因表达中重要的限速步骤，而这一过程往往需要1～2 周时间。目前开发的自配对型AAV（scAAV）能够解决这一问题，scAAV 基因组在进入宿主细胞后能够通过自我配对形成具有转录活性的双链形式，加快外源基因表达［18］。虽然使用scAAV 可加快外源基因表达，但更长的病毒基因组会压缩外源基因插入空间，导致能够接入外源片段的长度进一步缩短。

1.4 LV转导法 LV整个生命周期完成需要3个基因参与：gag、pol和env。其中gag基因编码慢病毒结构蛋白，pol基因负责将病毒基因组整合进入宿主基因组，而env基因则负责编码慢病毒包膜糖蛋白。LV 载体中使用水泡性口炎病毒糖蛋白编码基因VSV-G替换慢病毒env蛋白。VSV-G 蛋白能识别低密度脂蛋白（LDL）受体，使LV 载体能够识别并侵染多种细胞，提高LV 转染效率［19］。经过几代发展，LV安全性基本得到了保证。

除安全性和转染能力外，与AAV 载体相比，LV载体能稳定地将其基因组整合到宿主细胞基因组，不会随着细胞分裂导致外源基因丢失。LV 载体更偏好于将自己的基因组整合到转录基因下游区域，而非启动子区域［20］。与启动子区域相比，下游区域更稳定，更有利于保证插入基因长期稳定表达。LV能够接受的外源基因片段长度为9 kb，是AAV 的2 倍。与AAV 相同的是，LV 也存在一定免疫原性。除TLR2 能够识别其衣壳蛋白外，TLR7 和TLR9 能够识别LV 的基因组RNA，导致Ⅰ型干扰素产生［21-22］。目前可通过将LV 与地塞米松等免疫抑制药物联用抑制Ⅰ型干扰素产生，从而提高LV 转导效率［23］。需要注意的是，地塞米松可能导致巨噬细胞发生线粒体依赖性细胞凋亡，因此使用地塞米松提高LV 对巨噬细胞的转导效率时需格外注意巨噬细胞活性［24］。除TLR 外，巨噬细胞存在SAMHD1 蛋白，能够通过耗竭掉LV 逆转录所需的三磷酸核苷酸限制LV 逆转录过程。研究发现，包装LV 过程中整合1 个病毒蛋白X（Vpx）使SAMHD1 蛋白失活，提高LV 对巨噬细胞的编辑效率［25］。有趣的是，使用shRNA 耗竭掉THP-1 细胞的SAMHD1 后，发现耗竭掉SAMHD1 不影响THP-1 正常免疫应答，说明利用Vpx 使巨噬细胞SAMDH1 失活后，可能并不影响巨噬细胞的功能［26］。

1.5 生物材料法 近年生物材料表现出高可塑性、高容量、高安全性、高生物相容性、高转染效率，使其越来越受到重视［27］。生物材料可依赖巨噬细胞主动吞噬能力促进巨噬细胞对外源物质的主动摄取。生物材料颗粒大小、所带电荷和形状都会影响巨噬细胞对其吞噬［28］。研究发现，生物材料大小控制为30 nm～3 µm有利于巨噬细胞摄取，生物材料过大或过小均影响巨噬细胞摄取效率［29］。YU 等［30］发现带有强正电荷或强负电荷的生物材料能够以更快速度被巨噬细胞吞噬。巨噬细胞优先吞噬球状生物材料颗粒，而杆状或棒状颗粒则不易被吞噬［31］。因此，包装颗粒的选择很大程度影响巨噬细胞对生物材料的摄取效率，从而影响编辑效率。

1.5.1 脂质体 脂质体类型生物材料是目前最常用的生物材料。与常规脂质体转染不同，作为生物材料的脂质体需经过改造增加其靶向性和转染效率，同时延长其血液半衰期。研究发现，直径小于85 nm的带负电荷脂质体可促进单核/巨噬细胞对其吞噬；相反，大的带正电荷的脂质体更易引起单核/巨噬细胞激活［32］。目前临床常用的DOPC 脂质体经过不同表面修饰后能够促进M2 型巨噬细胞或/和Naïve 巨噬细胞向M1 型极化，为脂质体治疗疾病提供了新思路［33］。ANSELMO等［34］开发了一种扁平的圆形脂质体，称为“细胞背包”（cellular backpage，BPs），这种脂质体能够靶向单核细胞，BPs 接触到单核细胞后不会被吞噬，而是紧紧附着于单核细胞，且不影响单核细胞趋化功能和向巨噬细胞分化的潜力。利用单核细胞的趋化功能将携带药物的脂质体通过单核细胞携带到炎症组织，为治疗炎症性疾病提供了新策略。

1.5.2 无机纳米材料 纳米材料拥有广泛的临床疾病诊断和治疗潜力。根据纳米材料性质可将其分为无机纳米材料、有机纳米材料和有机-无机杂化纳米材料，其中无机纳米材料由于高稳定性、高可塑性受到青睐。目前常见无机纳米材料又可分为量子点（包括碳量子点、硅量子点、镉量子点，直径2～20 nm）、纳米二氧化硅（直径20～80 nm）和金属纳米颗粒（直径＜5.5 nm）等。研究发现，通过直接使用金属纳米颗粒、二氧化钛或包裹某些物质（IL-4、RGD 序列等）能够靶向诱导组织巨噬细胞极化，用于治疗急性肝炎、急性肾损伤或加快成骨和肌肉修复［35］。有趣的是，＜30 nm 的无机纳米材料常用于诱导M2 型巨噬细胞极化，而＞100 nm 的无机纳米材料则用于诱导M1 型巨噬细胞极化。碳纳米材料可在体内外引起巨噬细胞转录组改变，从而引起巨噬细胞M1 或M2 型极化［36］。体外研究表明，巨噬细胞极化水平与碳纳米材料处理浓度和时间相关［37］。因此需要根据目的选择纳米材料种类、大小及优化使用浓度和时间，以达到最佳的巨噬细胞改造效果。

限制无机纳米材料应用的最大问题是其人体毒性，无机纳米材料常在内皮系统中积聚，导致长期人体毒性和靶向性减弱。值得注意的是，不同无机纳米粒子联用可能增强细胞毒性，TSUGITA 等［38］发现，使用二氧化硅和二氧化钛同时处理巨噬细胞能够激活Caspase-1炎症小体，导致IL-1β产生，提示使用多种无机纳米材料进行巨噬细胞改造时应合理选择，降低细胞毒性。目前采取的方法有在无机纳米材料中加入有机结构（如PEG），即有机-无机杂化纳米材料加速纳米材料溶解或通过整合某些酶反应位点，促进氧化或还原反应，加快材料降解等［39］。

2 基因工程改造巨噬细胞与疾病

巨噬细胞具有可塑性，受其外界微环境影响发生极化。巨噬细胞根据激活方式不同常分为两个亚型：经典激活的M1 型和替代激活的M2 型。对巨噬细胞进行体内或体外的基因工程改造缓解甚至治愈某些疾病具有广阔应用前景。

2.1 基因工程改造巨噬细胞与肿瘤 目前已证明基因工程改造巨噬细胞在肿瘤诊断和治疗方面具有潜力（图1）。

2.1.1 基因工程改造巨噬细胞与肿瘤诊断 实体肿瘤微环境中常存在大量肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM），且TAM 往往与肿瘤预后不良相关［29］。AALIPOUR等［40］在小鼠模型中开发了一种过继改造后同源巨噬细胞诊断癌症的方法，发现小鼠过继的巨噬细胞能够迁移到肿瘤部位，且这一偏好比迁移到其他位置强4倍，迁移到肿瘤部位的巨噬细胞能够被肿瘤微环境诱导为M2型，Arg-1 表达上调200 倍，因此将荧光素报告基因与Arg-1 基因启动子相偶联并通过LV 转导改造巨噬细胞，从而实现荧光素在肿瘤微环境中的高特异性表达。过继改造巨噬细胞后，通过观察荧光信号分布能够发现25～50 mm3的肿瘤，对肿瘤的敏感性远超当前正电子发射断层扫描（positron emission tomography，PET）的200 mm3，可以发现更早期的肿瘤，为肿瘤诊断提供了更灵敏的手段。

2.1.2 肿瘤微环境内巨噬细胞改造 前文提到，肿瘤微环境中常存在大量M2 型巨噬细胞浸润，发挥免疫抑制功能，促进肿瘤血管形成、肿瘤转移，加速肿瘤生长［41-42］。目前治疗肿瘤思路之一是耗竭TAM 或驯化TAM 使其发挥抑制肿瘤生长功能。QIAN 等［43］开 发 了 一 种M2 型TAM 靶 向 纳 米 颗 粒M2NPs，并在M2NPs上装载了针对CSF-1R的siRNA，通过阻断M2型TAM 存活信号耗竭肿瘤微环境中的M2 型巨噬细胞。根据肺癌中TAM 叶酸受体β 上调的特点，TIE 等［44］通过将叶酸与脂质体融合靶向肺癌TAM，同时在脂质体中包裹1 个编码促凋亡蛋白BIM 的 质 粒 促 进TAM 凋 亡。ZHANG 等［45］开 发 了一种纳米载体包裹体外转录的IRF5 和IKKβ mRNA对TAM 中的M2 型巨噬细胞进行重编程，促进其向M1型极化，使其从促肿瘤状态转向抑制肿瘤发展状态。RODELL 等［46］设 计 了 一 种 装 载R848（一 种TLR7、TLR8 激动剂）的β-环糊精纳米颗粒靶向TAM，实现了TAM由M2型向M1型转化。

TAM 中除具有促进肿瘤生长的M2 型巨噬细胞，还有能够执行正常肿瘤杀伤功能的M1 型巨噬细胞，这些具有肿瘤杀伤潜力的巨噬细胞正常功能受到抑制或处于一种无应答状态，无法发挥正常的肿瘤杀伤功能。改造这类巨噬细胞使其发挥正常功能也是一个肿瘤治疗策略。抑制受体调节蛋白-α（SIRPα）是在髓系细胞表达的一类免疫检查点分子，能够与正常细胞的跨膜蛋白CD47 结合，从而抑制巨噬细胞对正常细胞的吞噬［47］。肿瘤细胞常有CD47分子表达，从而限制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。RAO 等［48］设计了一种基因工程细胞膜包被的磁性纳米颗粒（gCM-MNs），其中纳米膜囊泡包被SIRPα 突变体CV1，CV1 对CD47 的亲和力是正常SIRPα的50 000倍以上，可有效阻断SIRPα-CD47通路。而内部磁纳米颗粒可将gCM-MNs靶向至肿瘤微环境，并促进TAM由M2型向M1型极化。将gCM-MNs静脉注射到荷瘤小鼠中，肿瘤生长明显减缓，且未观察到明显体内毒性作用。除通过阻断SIRPα-CD47恢复巨噬细胞对肿瘤正常的吞噬功能外，研究人员在卵巢癌和三阴性乳腺癌中发现这些肿瘤高表达CD24，能与巨噬细胞Siglec 10 结合促进其免疫逃逸［49］。在巨噬细胞中敲除Siglec 10或使用抗体进行阻断后能够显著增加巨噬细胞对这些肿瘤的吞噬作用，为卵巢癌和三阴性乳腺癌这类无靶向药的肿瘤提供了新的治疗靶点［50］。此外，针对TAM 在肿瘤中无法执行正常抗原递呈作用这一问题，MURAOKA等［51］开发了一种胆固醇支链淀粉（cholesterol amylopectin，CHP）纳米凝胶，将CHP 纳米凝胶和肿瘤抗原复合物静脉注射荷瘤小鼠，发现CHP 抗原复合物能够有效聚集于肿瘤，恢复TAM 正常抗原递呈能力，从而激活CD8+T细胞，发挥抗肿瘤作用。

2.1.3 改造巨噬细胞作为药物载体 巨噬细胞被CCL2、CSF-1和补体级联产物等招募至肿瘤微环境，从而执行肿瘤杀伤功能或促进肿瘤发展和转移［52］。根据巨噬细胞能够越过生理屏障而被招募到肿瘤微环境的这一特点，科研人员尝试使用改造后的巨噬细胞作为药物载体达到向肿瘤中特异性递送药物并增加药物半衰期的目的［53］。CHOI 等［54］使用脂质体包裹阿霉素（Dox）增加巨噬细胞对Dox的摄取，且能够显著降低Dox 对巨噬细胞的毒性，巨噬细胞携带Dox 进入肿瘤后，随着Dox 释放杀伤肿瘤细胞。将金纳米颗粒（AuNS）与巨噬细胞共同孵育促进巨噬细胞对AuNS 的摄取，装载AuNS 的巨噬细胞在使用近红外激光照射时，导致巨噬细胞及其周围肿瘤细胞发生热诱导的死亡，这一治疗方法称为光热疗法［55］。目前这一治疗方法在体内或体外被证明对乳腺癌、头颈鳞癌等有良好的治疗效果［56-57］。尽管使用巨噬细胞进行药物递送能够提高对肿瘤的靶向性，降低全身反应性和延长药物半衰期等优点，需要注意的是，装载到巨噬细胞的药物对巨噬细胞具有毒性，CHOI 等［54］发现装载Dox 的巨噬细胞24 h后活性就会降低，因此巨噬细胞能装载的药物有限。此外，使用巨噬细胞进行药物递送时还存在脱靶效应，全身注射巨噬细胞48 h 后，除肿瘤部位外，肝脏、脾脏和肺中也观察到大量巨噬细胞积累［58］。这些因素可能限制改造巨噬细胞药物递送体系应用。

2.1.4 嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-M） 近年随着基因工程技术不断发展，体外改造巨噬细胞技术越来越成熟。最近，KLICHINSKY 等［59］通过AAV 载体Ad5f35 转导人THP-1 细胞系，构建表达针对HER2 嵌合抗原受体（CAR）的巨噬细胞（CAR-M），发现HER2 CAR-M 能够以剂量和时间依赖方式清除HER2+SKOV3卵巢肿瘤，且CAR-M 在肿瘤部位存活100 d 以上。重要的是，由于腺病毒载体Ad5f35的存在，使CAR-M始终处于M1型极化状态，保证了CAR-M 的抗肿瘤能力。ZHANG 等［60］构建了一种CAR-HER2-CD147，由用来识别人HER2 的scFV 胞外区和小鼠CD147 跨膜区和胞内区组成，利用LV转导方式构建了CAR-HER2-CD147-RAW264.7 细胞系，当CAR-HER2-CD147-RAW264.7 识别到肿瘤表面的HER2分子时，激活CD147下游信号通路，促进巨噬细胞产生基质金属蛋白酶降解肿瘤细胞外基质，从而增加T细胞浸润，发挥抗肿瘤作用。值得关注的是，CAR-HER2-CD147-RAW264.7 与HER2-4T1 在体外共培养并无直接杀伤肿瘤功能，说明改造后的巨噬细胞作用方式更加温和，毒副作用更小。

利用基因工程改造巨噬细胞治疗肿瘤已成为一种有前景的肿瘤治疗方式，但如何提高靶向性及降低人体毒性仍是亟待解决的问题。此外，大规模细胞检测技术、单细胞测序技术、多重免疫组化可帮助选择新的巨噬细胞靶点，从而提高治疗肿瘤效果［61］。总之，巨噬细胞凭借其强大的趋向性、可塑性，在肿瘤治疗中的地位逐渐凸显，巨噬细胞特异性靶点、高效率巨噬细胞改造工具和巨噬细胞靶向性生物材料等开发可能成为未来这一领域研究重点。

2.2 基因工程改造巨噬细胞与自身免疫病 巨噬细胞与多种自身免疫病相关，包括哮喘、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、自身免疫性神经炎、炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）、系统性硬化病等［62］。自身免疫病发生常伴随巨噬细胞浸润增加及M1与M2型巨噬细胞极化失衡。通过改造巨噬细胞进行免疫治疗是缓解某些自身免疫病的有效手段，具有广阔应用前景。

2.2.1 基因工程改造巨噬细胞与RA RA 是一类与M1/M2 比例失衡相关的自身免疫病［63］。研究发现，在小鼠体内通过注射AAV2/8 载体在巨噬细胞中过表达IL-38，可缓解胶原诱导关节炎和K/BxN 血清转移性关节炎小鼠症状［64］。此外，在THP-1 细胞系中使用LV 载体过表达IL-38 能够抑制IL-6、IL-23和TNF-α等促炎因子产生，说明IL-38过表达巨噬细胞在治疗RA方面具有潜力［64］。

2.2.2 基因工程改造巨噬细胞与肾小球肾炎 肾小球肾炎中常发现巨噬细胞浸润，说明巨噬细胞在肾小球肾炎中发挥作用。20 年前，WILSON 等［65］利用腺病毒载体在骨髓来源巨噬细胞中过表达IL-10并回输至小鼠，发现肾小球肾炎症状得到缓解。PEREIRA 等［66］使用DEF（一种铁螯合剂）在体内处理肾小球肾炎小鼠模型，通过改变巨噬细胞代谢方式限制巨噬细胞M1型极化缓解肾小球肾炎。

2.2.3 基因工程改造巨噬细胞与IBD IBD 包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。IBD 与M1/M2比例失衡而导致的肠道微生物或食物抗原耐受降低及慢性炎症相关［67］。有报道称，维生素D3的活性形式1，25（OH）2D3能够减少巨噬细胞TNF-α、IL-1β 和COX-2产生，并增加IL-10 产生［68］。ZAI 等［69］开发了一种不会被胃酸破坏的纳米结构脂质载体NLCs，通过口服给药方式到达肠道后被肠道巨噬细胞摄取，减少巨噬细胞炎症因子分泌，缓解IBD 症状。CAO 等［70］制备了一种利用壳聚糖包裹胰岛素样生长因子1C 端结构域（IGF-1）的水凝胶CS-IGF-1，将CS-IGF-1注射到小鼠体内能够激活并诱导M2 型巨噬细胞极化，从而促进IBD小鼠肠道上皮修复，减轻症状。

2.3 基因工程改造巨噬细胞与抗移植物排斥 器官移植是挽救终末期器官衰竭患者生命的一项重要策略。近年巨噬细胞在急性和慢性排斥反应中的作用受到重视。巨噬细胞在移植物中积累被认为是移植物排斥的特征之一，与患者预后较差相关［2］。肝脏缺血再灌注损伤中，供体肝脏中驻留的Kupffer 细胞向M1 型极化，造成移植物功能障碍［71］。急性排斥反应过程中，巨噬细胞能够产生IL-6、TNF-α、iNOS、MCP-1 等炎症因子和趋化因子招募和激活白细胞导致移植物微血管损伤。此外，巨噬细胞还能发挥抗原递呈作用激活适应性免疫细胞介导供体特异性细胞毒反应。除分泌炎症因子、发挥抗原递呈等作用介导急性排斥反应外，巨噬细胞可直接作为效应细胞通过穿孔素依赖途径直接排斥小鼠同种异体移植物［72］。慢性排斥反应在移植后数月至数年内发生，长期活化的巨噬细胞向M2 型偏移并发挥促纤维化功能［73］。据报道，术后1年，患者移植物内90%以上巨噬细胞表现出CD68+CD206+的M2 型巨噬细胞表型［74］。WU 等［75］使用氯膦酸脂质体清除心脏移植受体大鼠全身巨噬细胞后发现，心脏功能下降减缓，移植物存活时间延长。

巨噬细胞在诱导抑制免疫耐受方面也发挥重要作用。CONDE 等［76］在小鼠异位心脏同种异体移植模型中，使用anti-CD40L 单克隆抗体诱导耐受期间，观察到CD11b+CSF1R+Ly6CloLy6G-巨噬细胞在移植物中积累，这种积累依赖CSF1驱动的单核前体向Ly6Clo抑制性巨噬细胞增殖和转化。基于这一发现，BRAZA 等［77］制备了一种辛伐他汀-高密度脂蛋白纳米载体限制单核前体增殖，发现CSF1诱导的免疫耐受抑制状态被打破。说明CSF1 可促进单核前体增殖和向免疫耐受方向转化，可能是未来改造巨噬细胞发挥抗移植物排斥反应功能的潜在靶点。BRAZA 等［78］利用高密度脂蛋白包裹mTOR 抑制剂制备了两种纳米颗粒，这两种纳米颗粒联用可促进Ly6Clo巨噬细胞积累，移植后100 d，移植物存活率仍超过70%。Zbtb7a 表达仅局限于肺泡巨噬细胞，在肺移植小鼠模型中过继Zbtb7a 敲除的巨噬细胞能够通过降低肺泡巨噬细胞抗原递呈能力，限制T 细胞增殖，减轻支气管堵塞，延长移植物存活时间［79］。此外，IL-33能够刺激移植物内巨噬细胞脂肪酸摄取并限制巨噬细胞M1 型极化，减轻急性排斥反应［80］。IL-34 处理CD14++CSF-1R+PTPξ+单核细胞促进其向具有免疫耐受特性的巨噬细胞分化［81］。尽管目前基因工程改造巨噬细胞在抗移植物排斥方面的研究较少，前期基础研究为后期基因工程改造巨噬细胞提供了新靶点和思路，改造巨噬细胞在移植免疫中存在巨大应用潜力。

3 讨论

基因工程改造巨噬细胞为许多疾病如肿瘤、自身免疫病、感染性疾病、移植物排斥等提供了新的诊断方式、治疗思路和手段。多种以改造巨噬细胞为目标的疾病治疗手段已进入临床试验，如CAR-M、金纳米颗粒等，为使用现有手段难以治疗的疾病带来了新希望。尽管如此，现阶段基因工程改造巨噬细胞仍存在一些技术瓶颈需要克服和优化。首先是巨噬细胞难以转染的问题，现有转染手段或多或少存在靶向性低、效率不高、对细胞毒性大、引起细胞状态改变等问题，因此，需要对现有基因工程改造手段进行优化或开发新的改造方法提高转染和编辑效率，提高安全性，并根据治疗需要诱导巨噬细胞极化。改造能否能够稳定维持巨噬细胞特定功能也是考量其临床应用价值的重要因素。改造后的巨噬细胞应能够维持较长时间活性和稳定性而不会被微环境重新诱导。此外，如何有效降低临床应用成本也是改造巨噬细胞时需要考虑的重要问题。总之，基因工程改造巨噬细胞的临床应用仍有诸多问题需要解决。幸运的是，大量细胞分子生物学等领域新技术开发为有效解决基因工程改造巨噬细胞现有问题和瓶颈、实现巨噬细胞精准“驯化”及提高治疗效果提供了新手段和新策略。