吡格列酮影响紫杉醇诱导神经痛大鼠的作用机制

张月荣,张丽萍,章 阳,贾宏彬,陈珍珍

0 引 言

药物紫杉醇是目前常用的肿瘤化疗药物,但其可导致化疗后神经痛。目前研究认为,紫杉醇产生的神经痛可能与脊髓神经氧化应激反应、T型钙通道、神经元反应改变以及脊髓背角的促炎和抗炎信号传导异常有关[1-3]。激活或抑制这些受体或信号的传递可有效的缓解神经痛,如激活mTOR 和 PI3K 受体或抑制TRPA1和IL-6信号等[4-5]。此外,神经损伤后脊髓和大脑皮层中的星形胶质细胞在慢性神经病理性疼痛的形成和维持中发挥着重要作用[6-7]。反应性星形胶质细胞的表达增加对神经修复具有双重作用。一方面在神经损伤的初始阶段,反应性星形胶质细胞发挥着神经保护和修复的作用。另一方面反应性星形胶质细胞对损伤后神经功能恢复具有一定的抑制作用[8],如影响周围的G蛋白信号传导的表达参与伤害感受的调节,并以可逆和时间依赖的方式引发疼痛[9]。既往研究证实,促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6,以及胶质纤维酸性蛋白、连接蛋白和水通道蛋白4等参与了星形胶质细胞表现转化,促进神经病理性疼痛的发展[6,8,10-12,13-16]。既往大量研究发现,核受体过氧化小体增殖体激活型受体(peroxisome prolifterator-activatedreceptor, PPAR) 超家族成员PPARγ参与调控神经免疫炎症,具有一定的神经保护效应[12,17-18],可以通过激活PPARγ可以预防化疗药物导致的周围神经病变,缓解相关神经病理性疼痛[19-20]。吡格列酮为PPARγ的激动剂,通过抑制氧化应激反应、活化PPARγ联合信号通路等途径缓解化疗性神经病理性疼痛[21-22],但其作用机制是否与抑制星形胶质细胞的功能有关目前尚无定论。

1 材料与方法

1.1 建模与分组选择SD雄性大鼠32只,体重200～220 g,由南京大学附属金陵医院比较医学科提供,研究严格遵从《赫尔辛基宣言》要求。动物饲养的温度为18～22 ℃,湿度40%～70%,光照12 h,昼夜交替。实验动物生产许可证号:SCXK(军)2018-0006。所有大鼠经静置适应环境1周后,随机区组设计将大鼠分为4组:空白组,安慰剂组,治疗组和拮抗剂组(GW9662),每组8只。空白组第1、3、5、7天腹腔注射1 mL/kg等渗盐水,其余各组大鼠腹腔注射2 mg/mL的紫杉醇(2 mg/kg)制备紫杉醇诱导的慢性神经病理性疼痛大鼠模型。第7天测量冷缩足反应阈值(number of cold-stimulated paw withdrawal,TNCW)后,治疗组大鼠连续7 d腹腔注射10 mg/mL的吡格列酮(10 mg/kg),拮抗剂组大鼠于吡格列酮给药前30 min腹腔注射GW9662(2 mg/kg),所有模型组大鼠按1 mL/kg腹腔注射赋形剂20%二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)。

1.2 药物配置紫杉醇溶于20%DMSO中配置为2 mg/mL浓度;吡格列酮溶于0.9%的等渗盐水中配置为10 mg/mL浓度;GW9662溶于20%中配置为3 mg/mL浓度。所需药物均由南京索尔生物科技有限公司提供。

1.3 行为学测定TNCW的测定:给药当天及第2-14天测定大鼠的TNCW。将大鼠放置在金属网底( 孔径为5 mm×5 mm)的透明有机玻璃笼内, 适应30 min后采用0.1 mL丙酮刺激右后足足底部,记录30 s内的阳性反应(足抬起、甩腿、舔足或拭足)次数。测试3次, 测试间隔时间至少5 min,将3次的平均阳性反应次数作为 TNCW,所有测试均于8:00～10:00之间进行。

1.4 细胞因子(TNF-α、IL-1β)浓度测定第14天完成行为学检测后处死大鼠,取大鼠L5脊髓组织,采用大鼠TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒(TNF-α,Diaclone Research, Besancon Cedes, France; IL-1β,Biosource Europe SA, Niveiles, Belgium)测定TNF-α、IL-1β水平。按试剂盒内的说明书严格操作,使用测定波长450 mm时的光密度,作出标准曲线,进一步将样品光密度值代入标准曲线,并乘以相应的稀释倍数,计算出样品的细胞因子浓度,最后采用测定的细胞因子浓度除以样品的蛋白浓度,结果以pg/mg表示。

1.5 胶质细胞标志物(mRNA)表达水平的测定取大鼠L5脊髓组织,采用Trizol RNA试剂盒提取总核糖核酸、逆转录RNA为反向脱氧核糖核酸,使用Rotor-GeneTM 3000 实时定量多聚链反应检测仪 (Corbett Research, Sydney, Australia) 测定GFAP与基因β肌动蛋白(β-actin)的水平,计算两种标志物mRNA的表达量。β-actin和GFAP引物序列,正向引物为5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′, 5′-GCTGGAGCAAGACAAACATTC-3′;反向引物为: 5′-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3′,5′-CCCTACCCACTCCTACATCGT-3′。

2 结 果

2.1 吡格列酮对大鼠行为学的影响与空白组相比,腹腔注射紫杉醇各组大鼠TNCW次数明显增加(P<0.05);与安慰剂组比,在注射吡格列酮后治疗组大鼠TNCW次数显著下降(P<0.05),拮抗剂组与安慰剂组比TNCW差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 大鼠不同时间点冷刺激诱发缩足次数四组之间的比较Table 1 Number of feet withdrawal induced by cold stimulation at different time in rats

2.2 吡格列酮对腰脊髓组织细胞因子水平的影响与空白组相比, 成模各组大鼠脊髓L5脊髓中TNF-α和IL-1β表达明显增高(P<0.05);与安慰剂组相比,治疗组L5脊髓组织中TNF-α、IL-1β水平明显下降(P<0.05);拮抗剂组与安慰剂组比差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 吡格列酮对脊髓细胞因子含量的影响Table 2 The level of TNF-α and IL-1β in the spinal cord of rats

2.3 吡格列酮对脊髓胶质细胞标志物mRNA相对表达水平与空白组大鼠L5脊髓腰胶质细胞表面标志物GFAP的mRNA表达水平(92.88±8.15)相比,安慰剂组、治疗组、拮抗剂组(258.63±9.41,191.25±6.45,251.25±4.13)明显升高(P<0.05);与安慰剂组相比,治疗组GFAP mRNA表达水平显著下降(P<0.05),而拮抗剂组差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

紫杉醇对于恶性肿瘤的化疗有良好效果,属于一线化疗药物,应用广泛。但是临床发现,使用紫杉醇化疗后,患者发生周围神经痛的比例逐渐增多。紫杉醇神经毒性的发生率约为62%,许多患者无法承受化疗导致的神经痛而选择放弃化疗。目前氧化应激反应、神经元反应改变以及炎症因子和信号传导等被认为是化疗性神经痛产生的主要原因[1,3]。然而,星形胶质细胞同样作用于炎性因子的释放和信号通路的传导,其对神经病理性疼痛的发生发展起重要的作用[9,13-15]。

吡格列酮可以通过星形细胞和PPARγ的活化调节神经病理性疼痛的发生发展[12,18,23]。活化的星形胶质细胞释放促炎细胞因子(例如TNF-α和IL-1β),进一步影响突触前后膜的稳定性和兴奋性,参与痛觉易化的发生,我们通过检测化疗后的大鼠的腰脊髓发现,紫杉醇化疗也增加了脊髓炎性因子的浓度水平,这或许表示化疗性周围神经痛的机制与脊髓炎性因子的增加有关。但这是否与星形胶质细胞相关尚不明确,因此我们继续检测了星形胶质细胞的活化标志物GFAP mRNA,我们同样发现在紫杉醇治疗7 d后,脊髓GFAP相比空白组明显升高,这或许提示脊髓炎性因子的升高与星形胶质细胞活化有关。接着我们通过连续7 d腹腔注射吡格列酮,观察大鼠的行为学改变,并于7 d后检测腰脊髓炎性因子和GFAP水平,探讨吡格列酮用于治疗化疗性神经痛的机制。在7 d的观察期,痛觉过敏行为明显缓解,此外腰脊髓胶质细胞标志物GFAP mRNA表达水平及炎症细胞因子水平与vehicle治疗组比明显降低,当同时注射GW9662时,脊髓GFAP mRNA的表达较单用吡格列酮明显升高,提示吡格列酮可能通过先激活PPARγ再抑制星形胶质细胞的活化改变已发生的脊髓炎症反应,对化疗性周围神经痛大鼠有治疗作用。有研究证实了吡格列酮对神经病理性大鼠疼痛行为具有治疗作用,并认为与其抑制胶质细胞及降低血中的促炎细胞因子相关[23-25]。我们通过检测脊髓中的促炎细胞因子,发现脊髓炎性因子的降低同样与星形胶质细胞抑制有关。本研究揭示,吡格列酮用于治疗化疗性神经痛的机制不仅是抑制氧化应激反应,抑制星形胶质细胞活的化同样是治疗化疗性神经痛的机制之一。未来,我们将继续研究吡格列酮治疗后大鼠近、远端肢体表皮角质细胞以及神经纤维密度的改变,探讨吡格列酮治疗神经痛可能的机制。由于时间和经费有限,本研究未纳入脊髓GFAP的免疫组化或免疫荧光染色实验,需在今后的实验中进一步改进。

综上,吡格列酮可以抑制紫杉醇诱导神经损伤导致的腰脊髓星形胶质活化,减少脊髓炎性细胞因子的释放,缓解大鼠化疗性周围神经痛,其作用可以被PPARγ拮抗剂GW9662翻转。因此,吡格列酮活化PPARγ抑制星形胶质细胞活化释放的炎性因子,从而改善化疗性神经痛。