基于淫羊藿治疗下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤药物有效化学成分及其作用靶点的网络药理学与分子对接技术分析

王春玲, 吴思诺, 于晓艳, 张伟东

（吉林大学药学院药学系，吉林 长春 130021）

下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤是临床常见症候，与糖皮质激素戒断综合征相似，主要表现为肢体功能减退、畏寒怕冷和精神不振等症状，严重者甚至可能引起生精功能障碍，导致不育和先天缺陷，影响数万个家庭［1-3］。研究［4-8］显示：下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤主要与神经内分泌免疫系统（neuroendocrine immune system，NEIS）有关，特别是在慢性疾病（类风湿性关节炎、糖尿病和高血压等）后期其发生率较高。中医学理论中，下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤的基本病机以“肾阳虚衰”为主，其治疗主要以补肾壮阳和祛风除湿为关键。中医药在治疗下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤方面具有较好的效果及经验，广泛应用于临床治疗。淫羊藿又名仙灵脾，是小檗科淫羊藿属的多年生草本植物，主要有效成分为黄酮类物质和多糖类化合物等［9-14］。研究［15-17］显示：淫羊藿能有效减轻下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤大鼠的病情和改善多种原因引起的睾丸损伤及慢性肾功能衰竭大鼠肾间质纤维化程度。研究［18-20］显示：淫羊藿的补肾作用主要是通过调节激素受体活性或利用下丘脑促性腺激素释放激素信号及促性腺激素释放分泌等途径实现的。目前淫羊藿药材用于治疗下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤的作用机制尚未明确，为了探讨其作用机制，本研究采用网络药理学联合分子对接技术分析淫羊藿治疗下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤的药物有效化学成分及可能发生治疗作用的靶点，为进一步研究淫羊藿治疗下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤提供依据。

1 材料与方法

1.1 淫羊藿有效化学成分的检索淫羊藿药材的化学成分来自中药系统药理学（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP） 数据库和分析平台（https：//tcmspw.com/tcmsp.php/） 中 保 留 类 药 性（drug-likeness，DL）>0.18 的化学成分，在此基础上筛选出口服利用度（oral bioadoption，OB） >30% 的化学成分，满足此条件的大多数化合物可以到达细胞中的特定蛋白质靶点；结合相关文献，整理淫羊藿的有效化学成分和靶点蛋白的信息，并在Uniprot 蛋白数据库（https：//www.uniprot.org/）中将淫羊藿有效成分的靶点名称正式化，采用官方基因符号进行后续分析。

1.2 淫羊藿有效化学成分与下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤基因靶点相互关系网络绘制将“1.1”中已收集药材的成分和靶点信息与疾病进行联系。 采用DisGenet 基因数据库（https：//www.disgenet.org/），以下丘脑-垂体-性腺轴功能障碍 （dysfunction of hypothalamicpituitary-gonadal axis）、下丘脑-垂体-甲状腺轴功能障碍（dysfunction of hypothalamic-pituitary-thyroid axis） 和 下 丘 脑- 垂 体- 肾 上 腺 轴 功 能 障 碍（dysfunction of hypothalamic-pituitary-adrenal axis）作为关键词检索下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤相关的靶点基因，结合GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）中的信息进行补充。由于不同数据库可能会检索到相同的靶点基因，所以删除重复的靶点基因，得到下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤相关靶点基因。收集淫羊藿中的有效化学成分与下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤相关的靶点基因的交集靶基因。采用Cytoscape 3.7.1 软件，将药材与疾病的交集靶基因和有效化学成分构建药物-有效化学成分-疾病-靶点相互作用的网络并进行可视化。

1.3 蛋 白-蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）网络的绘制在STRING 数据库（https：//string-db.org/）中导入淫羊藿与下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤疾病的重叠靶基因，分析重叠靶点的PPI 网络。Cytoscape 3.7.1 软件处理PPI 信息，得到主要靶点蛋白信息，优化PPI 网络图。

1.4 淫羊藿治疗下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤潜在靶点的基因本体（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析将“1.2”中得到的交集靶基因的Entrez ID 导入基迪奥生物信 息 云 平 台 （OmicShare） （https：//www.omicshare.com/）进行GO 功能富集分析，研究淫羊藿治疗下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤的生物学机制；进行KEGG 信号通路富集分析，得出淫羊藿治疗下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤可能发挥作用的通路。

1.5 淫羊藿有效化学成分和治疗靶点的分子对接采用分子对接技术预测淫羊藿中关键有效化学成分和可能发挥治疗下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤作用的核心靶点的结合位点以及亲和力。首先进行小分子配体文件的制备：将下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤的核心靶点蛋白的结构在蛋白数据库中提取出来，然后进行去水去配体等优化后保存为PDBQT 格式。制备大分子化合物文件：在PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 中获取用于分子对接研究的淫羊藿有效化学成分的结构，将其导入Chem Bio3D 软件进行转换，展示淫羊藿有效成分的3D 格式，保存为PDBQT 格式。通过Autodouk Tools 软件进行对接，选择对接结果稳定的构象进行可视化。

2 结 果

2.1 淫羊藿的有效化学成分以OB>30% 和DL>0.18 为条件，在TCMSP 中进行初步筛选，得到淫羊藿的有效化学成分23 个，为槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）、木樨草素（MOL000006）、大黄酚（MOL003044）、乙酸亚油脂（MOL001645）、谷甾醇（MOL000359）和木兰花内酯（MOL00062）等。将淫羊藿中含量丰富但未满足筛选条件的脱水淫羊藿素（MOL004373）、宝藿苷（MOL004397）、淫羊藿次 苷Ⅰ （MOL004430） 和 淫 羊 藿 次 苷Ⅱ（MOL004431）添加至淫羊藿的有效化学成分中；采用Uniprot 数据库将筛选出的靶点，转换为正式基因名称，最终确定淫羊藿有效化学成分27 个，靶点基因214 个。

2.2 淫羊藿有效化学成分与下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤基因靶点相互关系网络将关键词下丘脑- 垂体- 性腺轴功能障碍（dysfunction of hypothalamic-pituitary-gonadal axis）、下丘脑-垂体-甲状腺轴功能障碍（dysfunction of hypothalamic-pituitary-thyroid axis）、下丘脑-垂体-肾 上 腺 轴 功 能 障 碍 （dysfunction of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis）导入GeneCards数据库和DisGeNET 数据库，共筛选出下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤的靶点基因465 个。将淫羊藿作用靶点与下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤作用靶点输入至Venny2.1.0 数 据 平 台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）进行交集靶点的获取，最终得到交集靶点基因62 个。见图1。对62 个交集靶点进行分析，结果显示：其中有10 个淫羊藿的有效化学成分与靶基因有关。采用Cytoscape 3.7.1软件构建淫羊藿-淫羊藿有效化学成分-疾病-作用靶点的PPI 作网络并进行可视化见图2。图2 中黄色三角形节点表示淫羊藿药材；蓝色圆形节点表示淫羊藿的有效化学成分，共10 个；红色四边形节点表示疾病，红色圆形节点表示引起疾病的靶腺轴；绿色方形表示靶点蛋白，共62 个；黑色线条表示PPI 关系；根据Cytoscape 3.7.1 软件计算度值，度值排名靠前的有效化学成分分别为槲皮素、木樨草素和大黄酚等。

图1 淫羊藿与下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of epimedium and hypothalamuspituitary-adrenal gland/gonad/thyroid gland axis function damage targets

图2 药物-有效化学成分-疾病-靶点网络图Fig.2 Network diagram of drug-effective chemical components-disease -target

2.3 STRING 数据库获取交集靶点的PPI 网络共得到669 个互作关系，平均节点度为61，将蛋白互作信息导入Cystosacpe 3.7.1 软件进行可视化得出靶点蛋白的PPI 网络图，见图3。其中节点与度值间存在一定的关联性，节点越大，度值越高，关联越密切，说明本靶点与其他靶点之间的相关性越强，因此该靶点在PPI 网络中可能发挥关键作用。排名前10 的靶点蛋白作为核心靶点，分别是含天胱氨酸的半胱氨酸蛋白酶3 （Cysteine protease 3 containing cysteine，Caspase-3）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、原癌蛋白（protein c-Fos， FOS）、 肿 瘤 坏 死 因 子（tumor necrosis factor， TNF）、 低 氧 诱 导 因 子 1α （hypoxiainducible factor-1 alpha，HIF1A）、血管内皮生长因子 A （vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、 白 细 胞 介 素1β （interleukin-1 beta，IL-1β）、 雌 激 素 受 体1 （estrogen receptor 1，ESR1）、 前 列 腺 素 内 过 氧 化 物 合 酶 2（prostaglandin endoperoxidase synthase 2，PTGS2）和基质金属蛋白酶9 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9），靶点蛋白的PPI 网络图见图4。

图3 靶点蛋白的PPI 网络图Fig.3 PPI network diagram of target proteins

图4 核心靶点的相关参数Fig.4 Related parameters of core targets

2.4 淫羊藿治疗下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤的潜在靶点的GO 功能富集分析和KEGG 信号通路富集分析将62 个潜在靶点基因输入至OmicShare 数据库中，以P<0.05 为标准进行GO 功能富集分析和KEGG 信号通路富集分析，共获得53 个符合条件的信息，其中包括26 个生物过程（biological process，BP）的信息，15 个细胞组分（molecular function，MF） 的信息，12 个分子 功 能 （cellular componant， CC） 的 信 息。见图5。

图5 GO 功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis

交集靶基因在BP 中主要富集于生物调节、免疫系统过程和生殖过程等；在MF 中主要富集于细胞器、突触和膜等；在CC 中主要富集于抗氧化活性、核酸结合转录因子活性和分子功能调节器等。

KEGG 信号通路富集分析得到203 个通路。对前20 个通路进行分析结果显示：其共同靶点主要富集于激素调节、免疫炎症和能量代谢相关的通路，如白细胞介素17（interlukin-17，IL-17）信号通路和癌症通路，在糖尿病并发症中发挥作用的AGE-RAGE 信号通路、炎症性肠病（inflammatiory bowel disease，IBD）、内分泌的阻力和TNF 信号通路等。见图6。

图6 潜在靶点的KEGG 信号通路富集分析Fig.6 KEGG signaling pathway enrichment analysis on potential targets

2.5 淫羊藿的有效化学成分和下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤核心靶点蛋白的分子对接KEGG 通路富集分析结果显示：主要涉及到激素调节、免疫炎症和能量代谢等环节，结合PPI网络筛选的淫羊藿治疗下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤的核心靶点蛋白，将与激素调节相关的靶点蛋白AR、抗炎免疫相关的靶点蛋白IL-6、促分裂原活化蛋白激酶1 （mitogen-actived protein kinase 1，MAPK1）和能量代谢相关的靶点蛋白MAPK1 及PTGS2 作为模板蛋白。淫羊藿苷在筛选过程中度值较低未能被准确筛选出来，但其在淫羊藿中含量丰富，在治疗下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤中已有应用，因此将木犀草素、槲皮素、山柰酚和淫羊藿苷等有效化学成分与模板蛋白进行分子对接，分子对接结果见表1。分子对接结果显示：淫羊藿药材的关键有效化学成分与选择的核心靶点蛋白存在很好的结合作用，其中槲皮素与MAPK1、木樨草素与IL-6、木樨草素与AR，山柰酚与PTGS2 的对接结果较好，对其进行可视化结果见图7。

表1 分子对接结果Tab.1 Molecular docking results

图7 分子对接模型Fig.7 Models of docking models

3 讨 论

本研究在PPI 网络构建中以度值对核心靶点蛋白进行筛选后分析发现：核心靶点蛋白大多与免疫炎症细胞因子、 能量代谢和激素调节蛋白（CASP3、IL-6、FOS、TNF、HIF1A、VEGFA、IL-1β、ESR1、PTGS2、MMP9、AR 和MAPK1等）有关联，表明淫羊藿可能干预患者的下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴，通过促进生殖器官的发育调节睾酮等性激素水平；诱导Th1 细胞、T 淋巴细胞和B 淋巴细胞等免疫细胞和细胞因子的增殖，抑制炎症因子的表达，减少炎症介质的释放，调节甲状腺激素的分泌，改善机体糖脂代谢水平等进而发挥抗炎、免疫、激素调节和能量代谢的作用［21-25］。

KEGG 通路富集分析结果显示：抗炎免疫和控制能量代谢相关的通路在KEGG 富集结果中占比较高。IL-17 通路是富集结果排名靠前的通路，表明 淫 羊 藿 可 能 通 过 调 控CCL2、IL-6、IL-1β 和TNF 等靶点蛋白来提高下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤患者免疫抗炎的功能［26-28］；在控制能量代谢的通路中，调控糖类代谢的过程和细胞凋亡过程可以控制细胞增殖和生长，从而发挥重要生物学作用［25］。

研究［28］显示：大蛋白受体与相对分子质量小的化合物结合越稳定，结合能越低。分子模拟对接结果显示：淫羊藿苷、槲皮素、木樨草素和山柰酚与IL-6、PTGS2、AR 和MAPK1 结合具有较高的稳定性。对得到的有效化学成分、核心靶点和通路进行逐一分析，发现淫羊藿有效化学成分可能通过与IL-6、PTGS2、AR 和MAPK1 结合，促进雄激素受体表达，改变钙离子（Ca2+） -三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶的活性，诱导氧化应激反应，进而激活睾丸线粒体中P38 和MAPK表达影响男性生殖功能［29-30］，在抗炎免疫和抑制炎症因子的形成过程中也发挥一定作用。

本研究采用网络药理学初步阐明了淫羊藿用于治疗下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤潜在有效化学成分及作用机制，其中起到治疗作用的关键有效化学成分为淫羊藿苷、槲皮素、山奈酚和木樨草素；大部分核心治疗靶点和通路与抗炎免疫、能量代谢及激素调节有关联。在网络药理学方法基础上进行分子对接验证预测结果与网络药理学结果一致，关键有效化学成分和起治疗作用的靶点蛋白可以稳定结合。本研究结果为下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴功能损伤的治疗提供了参考，为寻找药物治疗疾病的潜在机制提供了依据。