丹皮酚对人骨肉瘤MG-63 细胞增殖、迁移和CXCR4/STAT3通路的影响

吴 琪, 陈建锋, 李 浩, 文 峰

（1.湖北中医药大学临床技能实训中心针骨实验室，湖北 武汉 430000；2.湖北中医药大学附属医院骨科，湖北 武汉 430000）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一种恶性结缔组织的骨骼系统肿瘤，研究［1-2］显示OS 患者5 年生存率低于20%。现阶段OS 主要治疗手段包括新辅助化疗、手术切除和术后辅助化疗。尽管化学疗法是治疗OS 的重要方法之一，但化疗的不良反应会增加患者的疼痛并损害患者的其他身体功能。因此寻找有效且不良反应少的新型抗肿瘤药物一直是医学界研究的热点。中草药在肿瘤的诊治方面具有多靶点、多途径和不良反应少的优势。丹皮酚是一种中药活性成分，有较为广阔的抗肿瘤应用前景［3］。研究［4-5］显示：趋化因子受体4（chemokinereceptor 4，CXCR4）在OS 患者肿瘤组织中呈异常高表达并与患者存活率有关。CXCR4/信号转导和转录激活因子3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路在调控肿瘤细胞的增殖、周期、迁移和侵袭等方面也起重要的作用［6-7］。但目前关于丹皮酚对OS 细胞中CXCR4/STAT3 通路影响的研究较少，因此本课题组探讨丹皮酚通过CXCR4/STAT3 通路对人OS MG-63 细胞的作用，为丹皮酚的体外抗肿瘤机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人 OS MG-63 细胞购自武汉普诺赛公司。丹皮酚购自美国Selleck 公司，对照质粒和CXCR4 过表达质粒均购自北京义翘神州生物有限公司，CCK-8 检测试剂盒购自上海碧云天生物公司，转染试剂Lipofectamin 2000 购自美国Invitrogen 公 司， 放 射 免 疫 沉 淀 法 （radio immunoprecipitation assay，RIPA） 裂解液、蛋白提取试剂盒和BCA 蛋白浓度测定试剂盒均购自北京索莱宝生物有限公司，GAPDH、CXCR4、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、STAT3 和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP） 标记二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司，磷酸化STAT3 （phosphorylated STAT3，p-STAT3） 购自美国CST 公司。离心机和移液枪购自德国Eppendorf 公司，酶标仪购自美国Thermo 公司，超低温冰箱购自青岛海尔股份有限公司，CO2恒温培养箱购自日本Sanyo 公司。

1.2 细胞培养将MG-63 细胞置于含10%FBS、1%青霉素-链霉素的MEM 培养基中生长，并置于37 ℃、5%CO2相对饱和湿度的孵育箱中培养。根据细胞生长情况2～3 d 传代1 次，采用0.25%胰酶消化，取对数生长期生长状态良好的细胞进行实验。

1.3 CCK-8 法检测细胞存活率取对数生长期生长状态良好的MG-63 细胞，采用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM 培养基调整细胞密度至1×105mL－1，接入96 孔细胞培养板，每孔加入100 μL 细胞悬液，实验分为对照组和不同浓度丹皮酚组。其中不同浓度丹皮酚组分别加入10、20、40、80、160 和320 mg·L－1丹 皮 酚 处 理 细 胞24 h［8］，另设空白孔。实验重复3 次。加药培养结束后加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育4 h，于酶标仪450 mm 波长处测定各孔吸光度（A）值，计算细胞存活率。细胞存活率=［（实验孔A 值－空白孔A 值）/（对照孔A 值－空白孔A 值）］ ×100%。根据细胞存活率选择半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50） 值，作 为 后 续 实 验药物浓度。

1.4 Western blotting 法检测各组MG-63 细胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 和STAT3 蛋白表达水平

按照蛋白提取试剂盒步骤提取细胞总蛋白。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳，转移至PVDF 膜上，采用5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，分别加入GAPDH 一抗（1∶20 000 稀释）、CXCR4 一抗（1∶1 000 稀释）、IL-6 一抗（1∶500 稀释）、STAT3 一抗（1∶1 000稀释）和p-STAT3 一抗（1∶1 000 稀释），4 ℃孵育过夜，TBST 清洗3 次后，加入HRP 标记的二抗（1∶5 000 稀释），室温下孵育2 h，TBST 缓冲液清 洗 4 次。 加 入 电 化 学 发 光（electrochemiluminescence，ECL） 显影 后扫描胶片，采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参GAPDH 条带灰度值。

1.5 细胞转染和实验分组将MG-63 细胞分为对照组、丹皮酚组、丹皮酚+空载组（215.8 mg·L－1丹皮酚+ 空载质粒） 和丹皮酚+ 过表达组（215.8 mg·L－1丹皮酚+CXCR4 过表达质粒）。对照组：MG-63 细胞正常培养； 丹皮酚组：215.8 mg·L－1丹皮酚处理MG-63 细胞；丹皮酚+空载组和丹皮酚+过表达组：根据Lipofectamin 2000 转染试剂说明书分别转染对照质粒和CXCR4过表达质粒48 h 后加入215.8 mg·L－1丹皮酚处理MG-63 细胞。

1.6 细胞划痕实验检测各组细胞划痕愈合率实验分为对照组、丹皮酚组、丹皮酚+空载组和丹皮酚+过表达组。将细胞接种于6 孔细胞培养板上，质粒转染细胞48 h 后采用10 μL 无菌塑料移液管尖端轻轻刮擦附着的细胞产生单个划痕。采用无血清培养基洗涤细胞，去除刮起的漂浮细胞，加入含丹皮酚或不含丹皮酚的无血清培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养，并于0 和24 h 在显微镜下观察划痕处细胞生长状况，采用Image J 软件分析细胞划痕愈合率。细胞划痕愈合率= （0 h 划痕面积－24 h 划痕面积）/0 h 划痕面积×100%。

1.7 克隆形成实验检测各组细胞克隆形成率实验分为对照组、丹皮酚组、丹皮酚+空载组和丹皮酚+过表达组。将细胞接种于6 孔细胞培养板上，质粒转染细胞48 h 后收集细胞，以每孔250 个细胞接种于6 孔细胞培养板，待细胞贴壁后弃去原培养基加入含丹皮酚或不含丹皮酚的新鲜培养基，培养14 d 后除去培养皿里的培养液，采用4%多聚甲醛溶液固定细胞20 min，再采用结晶紫常温下染色30 min，显微镜下拍照，计数各组细胞克隆数，计算细胞克隆形成率。细胞克隆形成率=细胞克隆数/250×100%。

1.8 Western blotting 法检测各组MG-63 细胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 和STAT3 蛋白表达水平

实验分为对照组、丹皮酚组、丹皮酚+空载组和丹皮酚+过表达组。质粒转染48 h 后加入215.8 mg·L－1丹皮酚继续处理细胞24 h 后收集各组细胞，采用Western blotting 法检测各组细胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 和STAT3 蛋 白 表 达 水平，方法同“1.4”。

1.9 统计学分析采用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析。各组MG-63 细胞存活率、细胞划痕愈合率、细胞克隆形成率和细胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 及STAT3 蛋白表达水平呈正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组细胞存活率和丹皮酚IC50值与对照组比较，40、80、160 和320 mg·L－1丹皮酚组细胞存活率降低（P<0.05），其IC50值为215.8 mg·L－1，选择215.8 mg·L－1丹皮酚作为后续实验的药物浓度。见图1。

图1 CCK-8 法检测各组MG-63 细胞存活率Fig.1 Survival rates of MG-63 cells in various groups detected by CCK-8 method

2.2 各组MG-63 细胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3和STAT3 蛋白表达水平与对照组比较，丹皮酚（215.8 mg·L－1） 组MG-63 细 胞 中CXCR4、IL-6和p-STAT3 蛋白表达水平降低（P<0.05），STAT3 蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），表明215.8 mg·L－1丹皮酚抑制了MG-63 细胞中CXCR4/STAT3 通路的表达。见图2。

图2 各组MG-63 细胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 和STAT3 蛋白表达电泳图（A）和直条图(B)Fig.2 Electrophoregram（A）and histogram（B） of expressions of CXCR4, IL-6, p-STAT3， and STAT3 proteins in MG-63 cells in various groups

2.3 各组MG-63 细胞克隆形成率与对照组比较，丹皮酚组、丹皮酚+空载组和丹皮酚+过表达组MG-63 细胞克隆形成率降低（P<0.05）；与丹皮酚组比较，丹皮酚+空载组MG-63 细胞克隆形成率差异无统计学意义（P>0.05），丹皮酚+过表达组MG-63 细胞克隆形成率升高（P<0.05）。见图3 和4。

图3 结晶紫染色检测各组MG-63 细胞平板克隆形成情况Fig.3 Plate clone formation of MG-63 cells in various groups detected by crystal violet staining

图4 各组MG-63 细胞克隆形成率Fig.4 Clone formation rates of MG-63 cells in various groups

2.4 各组MG-63 细胞划痕愈合率与对照组比较，丹皮酚组、丹皮酚+空载组和丹皮酚+过表达组MG-63 细胞划痕愈合率降低（P<0.05）；与丹皮酚组比较，丹皮酚+空载组MG-63 细胞划痕愈合率差异无统计学意义（P>0.05），丹皮酚+过表达组MG-63 细胞划痕愈合率升高（P<0.05）。见图5 和6。

图5 各组MG-63 细胞迁移情况（×200）Fig.5 Migration of MG-63 cells in various groups（×200）

图6 各组MG-63 细胞划痕愈合率Fig.6 Scratch healing rates of MG-63 cells in various groups

图7 各组MG-63 细胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 和STAT3 蛋白表达电泳图（A）及直条图(B)Fig.7 Electrophoregram（A）and histogram（B） of expressions of CXCR4, IL-6, p-STAT3，and STAT3 proteins in MG-63 cells in various groups

2.5 各 组MG-63 细 胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3和STAT3 蛋白表达水平与对照组比较，丹皮酚组、丹皮酚+空载组和丹皮酚+过表达组MG-63细胞中CXCR4、IL-6 和p-STAT3 蛋白表达水平降低（P<0.05），STAT3 蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；与丹皮酚组比较，丹皮酚+空载组MG-63 细胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 和STAT3 蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），丹皮酚+过表达组MG-63 细胞中CXCR4、IL-6 和p-STAT3 蛋白表达水平升高（P<0.05），STAT3 蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。

3 讨 论

OS 患者的预后较差，容易复发或远处转移，发病人数约占骨恶性肿瘤的30%。目前对于OS 的治疗，一般术前化疗，然后行局部广泛切除的保肢术或行截肢术及术后化疗［9-10］。但化疗的不良反应会增加患者的疼痛并损害患者的其他身体功能。因此，需要寻找新型的治疗药物，一方面能对OS 细胞有较好的抗肿瘤效果，另一方面是不良反应少，从而进一步改善患者的预后。

中药因多靶点、多途径和不良反应少等特点在肿瘤的治疗中逐渐显示出一定的优势。近年来临床研究［11-12］显示：中医药联合手术、化疗和放疗等对肿瘤治疗有良好的效果。目前已有众多关于中医药抗骨肉瘤的临床及基础实验报道，中医药抗OS的作用机制不断被阐明［13］。丹皮酚具有镇痛、抗炎、抗氧化、抗过敏和抗病毒等药理作用，临床常用于治疗心脑血管、炎症和皮肤等疾病［3］。近些年研究也揭示丹皮酚还具有一定的抗肿瘤作用，对肿瘤有良好的治疗效果。LI 等［14］研究了丹皮酚对阿帕替尼耐药胃癌细胞的作用机制，其研究结果证实：丹皮酚能通过长链内含子RNA00665 （long intergenic non-coding RNA 00665， linc RNA 00665）/微 小 RNA-665 （microRNA-665， miR-665）/促分裂素原活化蛋白激酶1 （mitogen activated protein kinase 1，MAPK1）轴抑制阿帕替尼耐药的胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和糖酵解，促进细胞凋亡。ZHANG 等［15］研究证实：丹皮酚能通过调控STAT3/核因子κB （nuclear factor kappa B，NF-κB） 通路抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭，表明丹皮酚可作为一种肿瘤化疗抗转移候选药物。CAI 等［16］研究显示：丹皮酚通过调节肝癌细胞中的微小RNA-21-5p（microRNA-21-5p， miR-21-5p）/Kruppel 样 因 子6 （Kruppel like factor 8，KLF6） 轴进而抑制肝癌细胞活力、迁移和侵袭并引发肝癌细胞凋亡。细胞增殖是机体极为重要的基本生命特征，正常细胞增殖受到机体内严格调控，而不受机体控制且无限制的恶性细胞增殖则是肿瘤细胞的主要特征。因此有效控制肿瘤细胞的恶性增殖是评估药物可否作为抗肿瘤药物的主要指标之一。本研究结果显示：丹皮酚对OS MG-63 细胞活力有明显的抑制作用，表明丹皮酚对OS 有一定的治疗作用。

CXCR4 作为机体中极为重要的趋化因子受体，研究［4-5］显示：CXCR4 在骨肉瘤患者肿瘤组织中异常高表达且其表达量与患者存活率有关。CXCR4 参与了免疫细胞的募集，诱导IL-6 炎性细胞因子分泌增多， IL-6 与可溶性IL-6 受体（soluble IL-6 receptor，sIL-6R） 结合形成复合物，IL-6/sIL-6R 复合物能结合诱导细胞膜表面的糖蛋白130（glycoprotein 130，gp130）同源二聚，形成高亲和力的IL-6/sIL-6R/gp130 功能性受体复合物，进而导致Janus 激酶（Janus kinases，JAKs） 磷酸化而被激活，JAKs 活化可进一步导致STAT3 磷酸化［17-20］。STAT3 作 为STATs 家 族 的 极 为 重 要 的 关键成员，在多种肿瘤组织中异常激活。STAT3 被激活从细胞质中转移至细胞核并与特异性DNA 序列结合后通过调节下游靶基因的表达，进而促进肿瘤细胞抗凋亡、迁移侵袭和血管形成等能力，增强细胞的致癌作用［21-23］。本研究结果显示：丹皮酚处理后，MG-63 细胞中CXCR4、IL-6 和p-STAT3 蛋白表达水平降低，说明丹皮酚抑制了MG-63 细胞中CXCR4/STAT3 通路的表达。克隆形成率可以反映细胞群体依赖性和增殖能力，也可以较好地反映肿瘤的恶性程度，可较为简便而灵敏地检测药物引起的抑瘤性和促瘤性。肿瘤细胞具有向远处组织转移的能力，从而使肿瘤细胞可以从原位病灶脱离。细胞划痕实验是测定肿瘤细胞的迁移运动能力的方法，细胞划痕愈合率是评估肿瘤细胞迁移能力的重要指标。CXCR4/STAT3 通路改变对细胞的增殖和迁移等方面有一定的调控作用［6-7］。本文作者采用细胞克隆形成实验和细胞划痕实验发现丹皮酚能够降低MG-63 细胞的克隆形成率和划痕愈合率，说明丹皮酚可能通过抑制CXCR4/STAT3 通路进而调控MG-63 细胞的克隆形成和迁移能力。为了明确丹皮酚调控CXCR4/STAT3 通路可能是其抑制MG-63 细胞克隆形成及迁移能力的分子机制之一，本研究在MG-63 细胞中过表达CXCR4，发现CXCR4 过表达明显逆转了丹皮酚对CXCR4/STAT3 通路的抑制作用，增加MG-63 细胞中CXCR4、IL-6 和p-STAT3 蛋白表达水平，重新激活了CXCR4/STAT3 通路。CXCR4 过表达亦明显逆转了丹皮酚对MG-63 细胞的克隆形成和迁移的抑制作用，提高了MG-63 细胞的克隆形成和迁移能力，表明丹皮酚能够通过调控MG-63 细胞中CXCR4/STAT3 通路而起到良好的抗肿瘤作用。综上所述，调控CXCR4/STAT3 通路可能是丹皮酚抑制MG-63 细胞增殖、克隆形成和迁移能力的分子机制之一。