超高效液相色谱-串联质谱法测定全麦粉中的赭曲霉毒素A

唐德红，张 季，张冰雪，任 伟，张丹丹，刘 冲

（遵义市产品质量检验检测院，贵州遵义 563000）

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是食物中最常见的霉菌毒素之一[1]，是曲霉属和青霉属的真菌形成的次级代谢产物[2-4]，广泛存在于各种食物中。其中，谷物及其副食品是赭曲霉毒素A 的主要来源，其具有较强的肝毒性、肾毒性及免疫毒性，并可能致癌、致畸、致突变[5-8]，被认为是仅次于黄曲霉毒素类的真菌毒素类致癌物[9-13]。因此，防止污染赭曲霉毒素A 的食品直接进入人类食物链，加强对赭曲霉毒素A的检测具有重要意义。

近年来，用于分析食品中赭曲霉毒素A 的方法有高效液相荧光检测法、薄层色谱测定法、酶联免疫吸附法和高效液相色谱质谱法等，其中高效液相荧光检测法较为常用，但该方法限制条件严苛，影响结果的因素较多，且实测样品全麦粉基质较为复杂。高效液相色谱-串联质谱法（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLCMS/MS）兼具液相色谱和质谱的特点，其灵敏度高、定量限低、选择性强、精密度高，且具有较好的分离能力。在数据定量过程中，该方法可排除样品中的假阳性结果，进一步确保实验数据和结果的准确性和可靠性。

全麦粉是小麦加工制成的具有纯籽粒营养的面粉，外层麸皮含有大量的粗纤维、抗性淀粉和低聚糖，对糖尿病患者身体健康尤为有利，可能会改善糖循环、降低血糖指数、血脂水平[14-16]，生活中可作为大多数烘焙食品的原料。全麦粉作为国家食品安全监督抽检实施细则中的重点品种，赭曲霉毒素A 为其必检项目，其主要来源于种植培育阶段、收割存储过程，受病害虫、温湿度、生长环境土壤气候影响[17]，容易在作物发生霉变后产生，及时发现能有效减少其对人体的危害。

《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）和《食品安全国家标准 食品中赭曲霉毒素A 的测定》（GB 5009.96—2016）对谷物类、豆类、酒类、咖啡类等的限量值及相关要求进行了规定，但由于小麦粉粒径较细，经原料直接粉碎后麸皮含量高、颜色深，基质复杂，常规的净化方法处理杂质不完全，受基质影响较大导致回收率低。基于此，本实验在国家标准的基础上，以未知浓度的考核样品、质控样品为研究对象，选择比较不同的免疫亲和柱，鉴于赭曲霉毒素A 本身的特性优化不用的洗脱溶剂，结合高灵敏度的超高液相色谱-串联质谱法（Ultra High Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS），建立快捷高效准确的分析方法，为实际生活中测定全麦粉中赭曲霉毒素A 提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

全麦粉样品购自国家粮食和物资储备局科学研究院，分别为全麦粉A、全麦粉B、全麦粉C，全麦粉阴性样品、质控样品。

1.2 仪器

1.3 试剂

赭曲霉毒素A（OTA）标准溶液（1.9 μg·mL-1，国家粮食局科学研究院）；赭曲霉毒素A 稳定同位素（[13C]-OTA）标准溶液（0.1 μg·mL-1，奥地利Romer公司）；乙腈、甲醇均为质谱级（美国天地有限公司）；乙酸（色谱纯，天津市科密欧试剂有限公司）；水为实验室自制。

1.4 实验方法

1.4.1 PBS 缓冲溶液的配制

准确称量8.0 g 氯化钠，1.2 g 磷酸氢二钠，0.2 g 磷酸二氢钾，0.2 g 氯化钾，加适量水超声使其完全溶解，加水定容至1 L。洗脱液由98 mL 甲醇和2 mL 冰乙酸混合而成。

1.4.2 标准溶液的配制

分别精密移取OTA 标准溶液、同位素内标液适量，用乙腈分别稀释成浓度为95 ng·mL-1、20 ng·mL-1的中间储备液，于-20 ℃冰箱中储存。临用时移取中间储备液适量，用乙酸-甲醇溶液配制浓度分别为0.475 ng·mL-1、0.950 ng·mL-1、1.900 ng·mL-1、4.750 ng·mL-1和9.500 ng·mL-1的系列标准溶液，每个标准系列的溶液内标含量均为1 ng·mL-1，现配现用。

1.4.3 样品制备

准确称取5 g 试样，加入一颗陶瓷均质子，准确加入20 mL 提取液（乙腈∶水=60 ∶40），置于涡旋振荡器，2 500 r·min-1提取30 min，11 000 r·min-1离心5 min，准确移取上清液2 mL，加入10 μL 内标储备液（浓度0.1 μg·mL-1的内标溶液），再加入13 mL PBS 溶液稀释，混匀，11 000 r·min-1离心5 min。取出免疫亲和柱，恢复至室温。将免疫亲和柱连接于注射器下，以每秒1 ～2 滴的流速使稀释液通过免疫亲和柱，用20 mL 水淋洗，弃去全部流出液，用剪去尖端的洗耳球抽干小柱，滤纸擦拭干亲和柱内壁水珠。准确加入2.0 mL 冰乙酸-甲醇洗脱液，收集全部洗脱液于试管中，经0.22 μm 滤膜过滤，进样分析。阴性样品、质控样品处理方法同上。

1.4.4 仪器条件

小型紧凑化是高功率脉冲驱动源的一个重要发展方向[1-4]，能够产生近似方波脉冲的Marx发生器受到了广泛关注[5-8]。一般将传统Marx发生器中的电容器改为脉冲形成网络，可使发生器输出近似方波脉冲，再将各级脉冲形成网络以Marx发生器的形式进行叠加，即可达到增加输出功率、大幅减小脉冲驱动源体积的目的。

（1）色谱条件。色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；进样体积：5 μL；流动相：A 相为乙腈，B 相为0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱，洗脱程序：0 ～1.0 min，70%B；1.0 ～2.5 min，70%B→40%B；2.5 ～4.0 min，40%B→0%B；4.0 ～5.0 min，0%B；5.0 ～6.0 min，0%B→40%B；6.0 ～8.0 min，70%B。

（2）质谱条件。离子源为带有Agilent 喷射流技术的电喷雾离子源；干燥气温度：250 ℃；干燥气流量：11 L·min-1；喷嘴电压：35 psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气流量：12 L·min-1；电喷雾电压为4 000 V；采用正离子扫描模式，多反应监测模式进行检测。

2 结果与分析

2.1 检测条件的优化

分别在正离子模式和负离子模式下，选择Q1 MS1 全扫描模式进行母离子扫描，获得在对应模式下的质荷比，利用Q3 MS2 碎片离子扫描模式，寻找二级质谱碎片离子。在优化过程中，发现负离子模式下母离子响应较低，且碎片离子较少，所以选择正离子模式分析，选择响应最高的两个碎片分别作为定量离子和定性离子。碰撞能以5 V 为间隔，从15 V 调至50 V，优化碰撞能，观察被测组分出峰时间，确保图谱由12 ～15 个采集点构成，确定驻留时间，最后采用多反应监测模式进行检测，相关定量及定性检测离子条件见表1。

表1 赭曲霉毒素A 及其内标的质谱条件

2.2 赭曲霉毒素A 免疫亲和柱的选择

在实验过程中，同时选择了A、B、C 3 个不同生产厂家的具有相同柱容量和柱体积的免疫亲和柱进行净化测定，测定的原理均为基于抗原抗体反应，赭曲霉毒素A 抗体连接在柱内凝胶上，样品中赭曲霉毒素A 抗原经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢通过赭曲霉毒素A 免疫亲和柱，在柱内与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他物质，用洗脱液洗脱赭曲霉毒素A，注入UPLC-MS/MS 仪器中检测。结果发现，厂家A 的免疫亲和柱回收率相对偏低，且批间稳定性差异较大，厂家B 和厂家C 的免疫亲和柱回收率均为85%以上，综合考虑成本价格，最终选择厂家B 的免疫亲和柱进行本次实验。

厂家A 回收率偏低的原因有以下几点：①由于赭曲霉毒素A 中含有保护凝胶和抗体的PBS 溶液，只能陆路运输，运送时间较长，无法确保整个运输过程中的温度与赭曲霉毒素A要求的储藏温度一致，可能导致回收率偏低；②免疫亲和柱的柱空白，即免疫亲和柱自身本底可能会干扰赭曲霉毒素A 的测定，从而影响回收率；③免疫亲和柱内抗体对有机溶剂的耐受性，样品经提取过滤，会用一定体积倍数的PBS 溶液稀释，使其有机溶剂的含量在10%以下，以避免对抗体的破坏。

2.3 洗脱溶剂的选择

在GB 5009.96—2016 的基础上，优化了洗脱液和洗脱液体积，采用标准中规定的洗脱液甲醇和含2%冰乙酸的甲醇进行洗脱，结果表明含2%冰乙酸的甲醇作为洗脱液时回收率更高，可能与赭曲霉毒素A 自身结构和理化性质相关。此外，本文进一步优化了洗脱液的体积，分别采用1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL 的含2%冰乙酸的甲醇作为洗脱液，对加标的全麦粉阴性样品进行洗脱，结果表明洗脱液体积为2.0 mL 时，回收率高于85%，洗脱液体积为1.0 mL 和3.0 mL 时，赭曲霉毒素A 回收率均偏低，可能是洗脱不完全或洗脱杂质的增加干扰了质谱的响应，最终依据实验具体过程和操作选择2.0 mL 含2%冰乙酸的甲醇作为洗脱液。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性

精密称取阴性样品5 g，按1.4.3 项下方法操作处理样品后，进样分析，获得阴性样品色谱图（图1）；将一定浓度对照品溶液加入5 g 阴性样品中，同样按“1.4.3”项下方法操作，进样分析，获得含对照样品色谱图（图2）；取待测样品5 g，依法操作待测样品色谱图（图3）。结果显示，全麦粉中内源性物质对待测物的测定无干扰。

图2 对照样品中OTA 及其同位素内标MRM 色谱图

图3 实测样品中OTA 及其同位素内标MRM 色谱图

2.4.2 标准曲线、检出限、定量限

取阴性样品5 g，分别依次加入不同浓度的标准溶液适量，按1.4.3 项下操作处理后进样分析，以待测物的峰面积与内标峰面积之比（A/Ai）为纵坐标，各待测物浓度为横坐标绘制标准曲线。结果表明，赭曲霉毒素在0.475 ～9.500 ng·mL-1具有良好的线性关系，其相关系数r为0.999 9，线性方程为Y=1.298X-0.043。全麦粉中赭曲霉毒素A 以3 倍信噪比确定检出限为0.68 μg·kg-1、10 倍信噪比确定定量限为2.27 μg·kg-1。GB 5009.96—2016 中规定了全麦粉中赭曲霉毒素A 的检出限和定量限分别为1.0 μg·kg-1和3.0 μg·kg-1，因此本方法检出限和定量限满足检测需求。

2.4.3 精密度

取阴性样品5 g，分别加入3 个不同浓度的标准溶液，分别配制含赭曲霉毒素A 的低、中、高3 个浓度（质量浓度依次为0.95 ng·mL-1、1.90 ng·mL-1、4.75 ng·mL-1）的质量控制（Quality Control，QC）样品，按1.4.3 项下操作处理后进样分析，每个浓度平行配制6 样本，于1 d 连续测定考察日内精密度，每次均制备标准曲线。将QC 样品经仪器检测所得A/Ai代入标准曲线，计算QC 样品的浓度，并与QC 样品理论浓度比较，得出该方法的精密度。如表2 所示，精密度RSD ＜2%，提示该方法精密度良好，符合标准分析方法要求。

表2 赭曲霉毒素 A 的精密度试验结果（n=6）

2.4.4 回收率

精密称取阴性样品5 g，分别添加赭曲霉毒素A至理论浓度为2.37 μg·kg-1、4.75 μg·kg-1、9.50 μg·kg-1，考察3 种浓度下该方法的加标回收，按1.4.3 项下样品前处理条件进行处理并测定，每个添加浓度3 个平行样品，计算回收率及相对标准偏差，结果见表3。由表3 可知，平均回收率在85.62%～99.42%，RSD在1.92%～4.66%，表明提取回收率良好，可用于全麦粉样品中赭曲霉毒素A 的测定。

表3 赭曲霉毒素 A 的方法回收率（n=3）

2.5 质控样品的测定

精密称取质控样品5 g，按1.4.3 项进行样品前处理，然后进样分析测定，测得质控样品含量为2.62 μg·kg-1，该结果在质控样值允许范围内[（3.1±0.676）μg·kg-1]，表明方法可用于全麦粉质控样品中赭曲霉毒素A 的测定。

2.6 全麦粉中赭曲霉毒素A 的测定

分别准确称取国家粮食和物资储备局科学研究院粮油质量安全研究所研制的全麦粉中赭曲霉毒素A（低、中、高）3 浓度水平质控样品5 g，每份称取6个平行，按优化好的前处理方法提取净化后，进样分析检测，结果如表4 所示。3 个样品含量分别为（2.15±0.07）μg·kg-1、（4.20±0.14）μg·kg-1、（8.26±0.18）μg·kg-1，且6 次独立实验的RSD 较小，提示该方法重现性好、稳定性高，可用于较为复杂基质中赭曲霉毒素A 的测定。

表4 样品中赭曲霉毒素A 的测定结果

3 结论

赭曲霉毒素A 是广泛存在的具有较强毒性的真菌毒素，对人类健康有潜在风险，建立健全高效准确快速的检验方法，有利于保障食品安全。本研究在现行检测赭曲霉毒素A 的国家标准的基础上，优化了前处理方法，采用同位素内标法处理样品，以减少实验误差，消除基质效应及离子化干扰，提高检测结果的可靠性和准确度；同时结合UPLC-MS/MS方法进行分析检测，较常用的液相色谱而言，不仅可以保留时间定性，同时能够满足定量离子、定性离子同时出峰，且与标准品一致，且离子丰度比达到要求，优化后的方法有效避免了假阳性结果，能够保证结果的准确性。此外，由于全麦粉色泽较深，麸皮细腻，选择免疫亲和柱法净化，样品更清洁，可减少复杂的基质干扰，但免疫亲和柱本质为抗原抗体特异性结合，因此确保亲和柱的有效性至关重要。结合最终结果可知，本方法可为全麦粉中赭曲霉毒素A 的快速准确分析检测提供参考，可为人们的健康安全提供保障。