圈养穿山甲血液生理生化特征研究

谢博文, 何海健, 谢纯刚, 王馨梅, 李 靖, 戴正宇,朱子航, 郑荣泉,5, 程宏毅,5, 王艳妮,5

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004;2.金华职业技术学院 农学院,浙江 金华 321000;3.金华市自然资源和规划局 野生动植物保护管理站,浙江 金华 321052;4.金华市陆生野生动物救护中心,浙江 金华 321052;5.浙江师范大学 浙江省野生动物生物技术与保护利用重点实验室,浙江 金华 321004)

穿山甲是穿山甲属(Manis)动物的总称,隶属鳞甲目(Pholidota)鲛鲤科(Manidae).全球有8个现存种,我国分布2种,为中华穿山甲(ManispentadactylaHodgson,1836)和马来穿山甲(M.javanicaDesmarest,1822)[1].中华穿山甲主要分布于长江以南的广大地区,曾为广泛分布、资源量较大的物种;而马来穿山甲在中国分布区狭窄,数量稀少,仅分布于云南局部地区[2].作为唯一的有鳞哺乳动物,穿山甲因其食用价值和药用价值遭到人们的乱捕滥猎,加之生境的丧失与破碎化,野外种群资源几近枯竭[3].为加强穿山甲保护,中国国家林业和草原局于2020年将穿山甲属下所有种由国家二级保护野生动物调整为国家一级保护野生动物,中华穿山甲和马来穿山甲还被《中国生物多样性红色名录——脊椎动物卷》和世界自然保护联盟濒危物种红色名录(IUCN red list of threatened species)评估为极危(critically endangered,CR).随着中国对穿山甲保护工作的重视,依法开展收容救护、疾病防控、人工繁育及野化放归等工作成为重点.国内外对穿山甲的研究主要集中于野外种群分布[4-5]、栖息地选择[6-8]、人工食物开发[9-11]、活动节律[12-13]、生物学特征[14-16]及系统发育与进化[17]等科学问题.Chin等[18]对1995—2004年死亡的台湾穿山甲(M.pentadachtylapentadachtylaLinnaeus,1758)病例的死因回溯调查发现,消化道和肝脏疾病是导致人工圈养穿山甲死亡率居高不下的原因,62个有病理病变纪录的资料显示,消化道病变、肝脏病变分别占比67.7%和54.8%;张富华等[19]报告了一起由于肠道寄生虫感染引起圈养马来穿山甲死亡的病例;潘红平等[20]从患有肠道炎的死亡穿山甲肝脏、肠道中分离出致病菌株革兰氏阴性杆菌;张晨琪等[21]也发现多起因感染摩氏摩根菌而导致穿山甲患肺炎、肺出血致死的病例.目前,关于穿山甲的生理生化研究鲜有报道,野外获救和人工圈养穿山甲的救治护理、疾病防治仍旧是复杂且重要的课题.一方面,穿山甲常因应激并发症、呼吸道感染、出血性胃溃疡、消化道腹泻、寄生虫感染、受伤和管理不善而死亡[22];另一方面,缺少适合的生理生化参考指标用以评估机体的健康状况,这让兽医工作者无法对患病个体进行准确诊断并施加救治,导致穿山甲治愈率和存活率低.

血液生理生化指标是临床诊断的重要基础数据,能反映动物机体循环系统及免疫系统的功能状态[23-24].血常规检验可作为由细菌和病毒性感染、寄生虫、过敏、贫血及脱水等引起的血液疾病的主要诊断手段.血清生化指标则用于对肝胆、肾脏、胰腺等重要器官的病理变化诊断,在判断机体状态、观察疗效和预后诊断方面具有重要的临床意义[25-26].血常规和血清生化指标参考区间将提供动物健康状况和疾病等信息,一旦偏离将提醒兽医及时、准确地进行医疗护理.然而,文献中关于中华穿山甲和马来穿山甲的血液生理生化参考数据有限,且穿山甲血常规和血清生化指标的种间差异对比研究未见报道.Khatri-Chhetri等[27]、Ahmad等[28]曾分别对散养的台湾穿山甲、新加坡野生动物保护区内圈养的马来穿山甲进行部分血液生理生化指标的测定.但在实际的临床诊断过程中,受限于物种差异(地域和生活史不同)、圈养方式不同及指标数量不足等缺陷,发现该研究结果对于目前圈养穿山甲的健康状况评估、疾病诊断与救治并不完全适用.

因此,本研究应用全自动动物血细胞分析仪和生化分析仪测定浙江省穿山甲保护繁育研究基地人工圈养环境中的4只成年雄性中华穿山甲和7只成年雄性马来穿山甲的18项血常规指标、15项血清生化指标,建立可靠的血液生理生化参考区间并进行各指标的物种间差异分析,为穿山甲的健康状况评估、疾病诊断与救助治疗提供科学依据,以提高这些动物在圈养过程中的治愈率和存活率.

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物为浙江省穿山甲保护繁育研究基地内圈养的4只成年雄性中华穿山甲和7只成年雄性马来穿山甲.穿山甲的年龄主要根据体质量进行判断,一般认为,穿山甲个体体质量超过3.5 kg的被视为成体[22].中华穿山甲为浙江省内野外获救的个体,人工圈养时间为2 a左右;马来穿山甲为浙江海关截获后安置于基地,圈养时长超过4 a.实验动物被安置于面积为6 m×3.5 m的圈舍内单独关养,圈舍内提供尺寸为2 m×1 m×0.5 m的带有通道的木制巢箱和清洁的饮用水盆.穿山甲白天蜷缩在木箱内睡觉,晚上从通道爬出至圈舍活动.圈舍内装有独立空调和地暖,温度恒定为(26.0±2.0) ℃,湿度保持在(60.0±5.0)%.饲养员每天8:00—9:00清洁圈舍,并记录动物的饮食、饮水、排便及其他情况,每天15:00—16:00喂食人工配制食物1次.食谱由全价猫粮、黑蚂蚁、面包虫、羊奶粉和饮用水组成,各成分混合后经食物搅拌机打成糊状,倒入清洁喂食盆中供个体自主采食.

1.2 临床检查

在采集圈养穿山甲血液之前,需经兽医对实验动物进行临床检查.个体行为活跃、精神状态良好、食欲正常、排尿排便正常被认定为健康,方可进行采血流程.实验期间,对个体进行体质量、体长、体温(腋温)、心率及呼吸数等常规指标的周期性测定,以监测动物的健康状况.如个体出现受伤、身体状况不佳、消瘦及呼吸异常等情况将不被采血.体质量和体长每周测量1次,体温、心率和呼吸数的测量频率为每日1次,测量时间均为上午.体质量的测量是利用电子台秤;体长利用皮尺或卷尺量取个体吻端至尾基的直线距离;体温的测定是采用电子温度计放置于腋下测定;心率的测定是记录个体安静状态下每分心跳的次数;呼吸数的测定是对胸腹部每分的起伏次数进行计数,一起一伏计为1次呼吸.

1.3 血液样本采集与处理

考虑到药物和麻醉处理可能会影响个体术后恢复至正常生理状态,采血时未对动物进行任何的化学药物镇静或麻醉处理.穿山甲血液的采集获得浙江省穿山甲保护繁育研究基地的许可,采集时间为2021年1月—2022年8月,采集周期为30 d.实验期间,实验个体未经历过抗生素注射或喂食驱虫药,且没有出现强烈的应激反应或死亡现象.血液样本取自人为约束的穿山甲尾巴腹侧中线的尾静脉[27].动物禁食12 h后,空腹非麻醉状态下使用一次性真空抗凝采血管(EDTA-K2,2.0 mL)和一次性真空普通采血管(3.0 mL)对穿山甲穿刺尾静脉采集血液.普通采血管中的血液样本于室温下放置1 h以上,待血液凝固后,经3 750 r/min离心5 min后分离得到血清,用于血清生化指标检测[28].血液样本经处理后均置于低温保存箱内,送至金华康美宠物医院进行血常规和血清生化指标的检测.

1.4 血液生理生化指标测定

应用ProCyte Dx全自动动物血细胞分析仪(美国爱德士生物科技有限公司)测定血液中18项血常规指标:白细胞(white blood cell,WBC)计数、淋巴细胞(lymphocyte,LYM)计数、单核细胞(monocyte,MONO)计数、嗜中性粒细胞(neutrophil,NEU)计数、淋巴细胞百分比(%)、单核细胞百分比(%)、嗜中性粒细胞百分比(%)、红细胞(red blood cell,RBC)计数、血红蛋白(hemoglobin,HGB)浓度、红细胞压积(hematocrit,HCT)、平均红细胞体积(mean corpuscular volume,MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin,MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)、红细胞分布宽度(red blood cell distribution width,RDW)、血小板(platelet,PLT)计数、平均血小板体积(mean platelet volume,MPV)、血小板分布宽度(platelet distribution width,PDW)及血小板压积(plateletcrit,PCT).

使用Catalyst One全自动生化分析仪测定血清中15项生化指标:血糖(glucose,GLU)浓度、肌酐(creatinine,CREA)浓度、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)浓度、磷酸盐(phosphorus,PHOS)浓度、钙(calcium,Ca)浓度、总蛋白(total protein,TP)浓度、白蛋白(albumin,ALB)浓度、球蛋白(globulin,GLOB)浓度、总胆红素(total bilirubin,TBIL)浓度、胆固醇(cholesterol,CHOL)浓度、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)活性、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALKP)活性、γ-谷氨酰转移酶(γ-glutamyltransferase,GGT)活性、淀粉酶(amylase,AMY)活性及脂肪酶(lipase,LIPA)活性.

1.5 指标参考区间的建立与种间差异分析

应用SPSS Statistics 26软件(美国IBM公司)对临床检查结果和血液生理生化检测结果完成统计与分析.首先应用非参数正态性检验方法中的K-S检验(Kolmogorov-Smirnov normality test)对各项指标数据进行正态分布检验,同时计算出所有指标的平均值(χ2)、标准差(S)及渐进显著性(双侧)P值.当指标数据符合正态分布时(P>0.05),其标准参考区间的建立可通过正态分布法计算得到双侧95%置信区间的参考范围(χ2±1.96S);当指标数据不满足正态分布时(P<0.05),标准参考区间的建立则应采取百分位数法计算得到双侧95%置信区间的参考范围(P2.5～P97.5)[29].正态分布法与百分位数法统计公式见表1.关于血液生理生化指标的种间差异分析,首先对指标进行方差齐性检验(F检验),对于指标数据满足方差齐性(P>0.05)即采用独立样本t检验进行组间的差异比较,不满足方差齐性(P<0.05)的指标则采用非参数检验方法的曼-惠特尼秩和检验(Mann-WhitneyUtest)进行种间差异评价,统计的显著性水平设定为0.05[22].

表1 医学参考区间的正态分布法和百分位数法统计公式

2 结果与分析

2.1 临床检查结果

圈养穿山甲的临床检查结果,包括体质量、体长、体温、心率以及呼吸数见表2.

表2 圈养中华穿山甲和马来穿山甲临床特征

2.2 血常规指标参考区间与种间差异

通过正态分布检验判断各项指标是否符合正态分布,运用正态分布法或百分位数法统计获得圈养穿山甲18项血常规指标的双侧95%置信区间的参考范围,建立各指标的标准参考区间.正态分布检验发现,淋巴细胞百分比检测结果不符合正态分布(P=0.012),故采用百分位数法取95%概率参考范围,其余指标采用正态分布法计算.

运用独立样本t检验或Mann-WhitneyU检验对圈养中华穿山甲和马来穿山甲的血常规指标进行比较研究,大多数指标未发现种间的显著差异(见表3).关于白细胞及其分类计数的指标中,白细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、嗜中性粒细胞计数、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比及嗜中性粒细胞百分比均不存在种间的显著差异(P>0.05);与红细胞计数及其相关指标中,有2项指标出现种间的显著差异,中华穿山甲组血液中平均红细胞体积与平均红细胞血红蛋白含量均显著高于马来穿山甲组(P=0.001,P=0.005),其他指标如红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积、平均红细胞血红蛋白浓度及红细胞分布宽度均无显著差异;与血小板计数及其相关指标中,中华穿山甲组血液中平均血小板体积和血小板压积显著高于马来穿山甲组(P=0.001,P=0.004),而血小板计数和血小板分布宽度未呈现统计学上的显著差异.

表3 圈养中华穿山甲和马来穿山甲血常规指标特征

2.3 血清生化指标参考区间与种间差异

统计得到圈养穿山甲15项血清生化指标标准参考区间.正态分布检验发现,肌酐浓度不符合正态分布(P=0.017),采用百分位数法取95%概率参考范围,其余指标采用正态分布法.

2种圈养穿山甲的15项血清生化指标的种间差异同样运用独立样本t检验或Mann-WhitneyU检验进行比较.由表4可知,与血常规指标相似,大多数血清生化指标并不存在显著差异,但有3项指标仍表现出种间的显著差异性,中华穿山甲组血清中血糖浓度、血尿素氮浓度及磷酸盐浓度显著高于马来穿山甲组(P<0.05).

表4 圈养中华穿山甲和马来穿山甲血清生化指标特征

3 讨 论

血液是动物体内循环系统的重要组成部分,承担着运输物质、生理调节及免疫防御等重要功能.血常规和血清生化指标可以为感染、炎症反应和内分泌代谢状态的潜在影响提供有价值的信息[30].然而,许多因素如年龄、性别、环境条件、饮食、应激、约束方式及分析方法等都可能导致血常规和血清生化数值发生变化[26,31-32].尽管国内外已经发表了关于穿山甲的部分血液生理生化指标参考值,但研究的对象多为台湾穿山甲(中华穿山甲亚种,分布于中国台湾地区)和分布于新加坡、泰国的马来穿山甲[22,27-28].物种类别、分布地域和生活史的巨大差异使得这些参考区间能否适用于国内穿山甲种群尚未明确,且并未有研究讨论关于穿山甲种间血液生理生化指标的差异.因此,本研究系首次对中国大陆穿山甲圈养种群的血液生理生化特征进行探索,建立了圈养中华穿山甲和马来穿山甲18项血常规指标和15项血清生化指标的标准参考区间,明确了指标在种间的差异关系.

研究结果表明,实验建立的圈养中华穿山甲和马来穿山甲血液生理生化指标的标准参考区间与先前报道[22,27-28]高度吻合,但部分指标仍出现一定偏差.圈养中华穿山甲血液中白细胞计数的参考区间上限((5.96～14.74)×109L-1)高于文献[22]中描述的圈养台湾穿山甲上限((3.50～11.2)×109L-1).与此同时,圈养马来穿山甲白细胞计数与嗜中性粒细胞计数参考区间(白细胞计数:(7.48～20.70)×109L-1,嗜中性粒细胞计数:(5.92～18.22)×109L-1)与新加坡圈养马来穿山甲(白细胞计数:(2.20～8.57)×109L-1,嗜中性粒细胞计数:(1.37～7.28)×109L-1)相比,前者参考区间上限均高于后者[28].白细胞计数及其相关指标数值的升高可能是由于采血过程中穿山甲处于生理兴奋状态,由于机体释放的内源性糖皮质激素的增加使得中性粒细胞释放增加而影响血液参数,内皮细胞附着力减弱,中性粒细胞循环时间延长,从而引起血液中白细胞和嗜中性粒细胞数量上升[33].研究结果还显示,圈养中华穿山甲血液中红细胞计数((5.32～8.34)×1012L-1)、血红蛋白浓度(8.36～13.40 mmol/L)、红细胞压积(42.75%～69.61%)及平均红细胞体积(74.41～90.45 fL)的参考区间上限也高于台湾穿山甲参考区间(红细胞计数:(3.83～7.41)×1012L-1,血红蛋白浓度:6.76～11.79 mmol/L,红细胞压积:30.50%～51.70%,平均红细胞体积:58.50～83.59 fL)上限[22].据此推测,造成红细胞计数及相关指标数值偏高的原因也可能是由于采血过程中人为束缚导致穿山甲应激增加,兴奋程度提高.机体应激或兴奋状态时,肾上腺髓质受到交感神经刺激而释放儿茶酚胺(catecholamine),引起脾囊平滑肌收缩,红细胞从脾脏释放到血流中,导致红细胞及其相关指标数值上升增加[34].文献中报道的穿山甲血液生理生化指标测定于个体的深度镇静状态,实验对象被放置于含有5%异氟醚和氧气的气室进行诱导麻醉,当动物失去翻正反应(righting response)时,通过佩戴面罩对其进行持续麻醉,穿山甲于安静状态被执行采血程序[22,28].而本实验中,考虑到麻醉处理可能会影响个体正常生理状态,采血过程中未对动物进行麻醉处理,而通过人为约束对穿山甲进行保定的方式及针刺的疼痛反应,都可能在一定程度引起了机体的强烈应激反应和生理兴奋,从而使部分血液生理生化指标出现波动.

血清生化结果表明,中华穿山甲血清中总蛋白浓度参考区间上限(4.23～6.08 mmol/L)高于台湾穿山甲参考区间上限(3.23～5.52 mmol/L),而碱性磷酸酶活性参考区间下限(29.56～176.44 U/L)低于台湾穿山甲下限(69.00～308.00 U/L).有研究表明,成年穿山甲的血清蛋白水平显著高于幼年穿山甲[35],这在台湾穿山甲[27]、其他野生动物[36]和家畜[37]中也有类似的发现.成年动物的高血清蛋白可归因于免疫球蛋白浓度随年龄的增加及其他蛋白质的积累,如转运蛋白、脂蛋白及纤维蛋白原等[28].本实验中,体质量作为衡量穿山甲个体年龄的指标[27],中华穿山甲组平均体质量((6.95±1.92) kg)远高于台湾穿山甲组((4.77±0.61) kg)[22],推测中华穿山甲年龄大于台湾穿山甲可能是造成中华穿山甲血清中总蛋白浓度高于台湾穿山甲的原因.同时,穿山甲的年龄还会影响血清中碱性磷酸酶的活性[35],这在其他动物中也被讨论过[37-38].碱性磷酸酶的各种同工酶广泛存在于肝脏、肾脏及骨等组织中.亚成体个体由于身体发育的需要,成骨细胞活性增加,导致骨组织中碱性磷酸酶的同工酶释放增多,碱性磷酸酶出现高活性[39],因此,出现中华穿山甲血清中碱性磷酸酶活性低于台湾穿山甲的现象.上述指标与已发表的参考值形成一定程度的偏差,说明中国大陆穿山甲圈养种群具有自身特殊的血液生理生化特性,但也不能忽视饲养管理、食物配置及人为约束方式的不同造成的影响[34,38].同时,采血操作中还应注意对动物约束方法的选择,减少个体的生理应激并获得更为准确的测量结果,从而降低实验误差,增强实验结果的可靠性.此外,实验建立的圈养穿山甲30余项血液生理生化指标标准参考区间与前人研究相比,测定项目更为齐全,包括血液淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、嗜中性粒细胞百分比、红细胞分布宽度、血小板分布宽度及γ-谷氨酰转移酶活性等多项之前未见报道的指标.

穿山甲血液生理生化指标的对比研究主要是有关性别、年龄、季节及野生与圈养等方面.Chin等[22]发现,圈养台湾穿山甲血液中平均红细胞血红蛋白浓度、血小板计数、总蛋白浓度及丙氨酸氨基转移酶活性等指标存在性别差异,而血小板计数和淀粉酶活性存在年龄差异.Khatri-Chhetri等[27]发现,野生台湾穿山甲的丙氨酸氨基转移酶活性、脂肪酶活性及磷酸盐浓度存在季节性差异.Ahmad等[28]比较了分布新加坡的野生和圈养马来穿山甲的血液生理生化指标,结果二者血液中的血红蛋白浓度、嗜中性粒细胞计数、总蛋白浓度、球蛋白浓度、碱性磷酸酶活性、血尿素氮浓度及磷酸盐浓度均存在显著差异.本研究结果显示,中华穿山甲的平均血小板体积、血小板压积、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量、血糖浓度、血尿素浓度及磷酸盐浓度显著高于马来穿山甲(P<0.05),其余指标并未发现种间的显著性差异.一般认为,影响动物血液生理生化指标的参数通常分为两大类,即遗传参数和非遗传参数.其中,遗传参数包括动物品种和基因型,非遗传参数包括动物年龄、性别、管理方式、是否用药及营养状况等因素[31,40].本研究中,实验对象的圈养时长均已超过2 a,且圈养环境相同,管理方式一致,个体均已适应圈养环境,健康状况良好.因此,推测在一致的人为控制环境中,非遗传参数并非造成圈养中华穿山甲和马来穿山甲血液生理生化指标形成显著差异的主要原因,2种穿山甲血液生理生化特性的差异主要归因于遗传参数中的物种差异.相似结论可见于多项研究,如Wiedmeyer等[41]对白足鼠属(Peromyscus)下的4个鼠种进行血液生理生化指标测定,发现大多数血液指标存在较大的种间变异;Isaac等[42]报道了在3种不同品种兔子血液中,白细胞数量、淋巴细胞数量、单核细胞数量及平均红细胞血红蛋白含量也存在品种间差异;Ahmed等[43]对裂腹鱼属(Schizothorax)的5种淡水雪鳟的血液生理生化指标的比较研究结果显示,白细胞计数、红细胞计数、血糖浓度及血尿素氮浓度等多项指标均存在种间差异;Mohammed等[44]还发现,在集约化生产系统下饲养的4种不同品种山羊的血液平均血小板体积和血小板压积也存在种间显著差异.此外,穿山甲血液生理生化特征的种间差异还可能与物种对环境的耐受能力和调节能力有关.本实验中,中华穿山甲的平均血小板体积与血小板压积显著高于马来穿山甲,而血液中平均血小板体积与血小板压积是衡量血小板功能和活性的重要指标,对细胞表面凝血反应的发生至关重要[45],由此推测,物种间凝血能力强弱可能是造成指标形成显著差异的原因.有关红细胞计数及其相关指标显示结果,圈养中华穿山甲的血液平均红细胞体积和平均红细胞血红蛋白含量显著高于马来穿山甲,这可能与中华穿山甲的高活动性和高代谢率有关.在日常行为观察中,中华穿山甲表现出更高的活动性,而马来穿山甲由于圈养时间更长(超过4 a),且圈舍环境丰富度低,马来穿山甲的活动次数和持续时间均低于中华穿山甲.同时,圈养中华穿山甲血清中血糖浓度显著高于马来穿山甲,这可能是由于中华穿山甲更高的运动量导致了肝糖原消耗增加,血清中检测到的血糖浓度升高.运动量的增加也会导致机体失去更多水分,造成血液浓缩,血尿素氮浓度上升,而低活动性也可能是马来穿山甲的血清中磷酸盐浓度较低的原因[46].因此,研究结果给穿山甲圈养管理工作提出了新要求,即对穿山甲的圈舍环境应进行丰容处理,并尽可能模拟野外环境,以通过增加环境丰富度和环境异质性来提高穿山甲的活动性;同时应提供让穿山甲随时自由饮水的装置,以免机体失水过多.

本研究建立的穿山甲血常规和血清生化指标参考区间及体质量、体温和心率等基础临床数据是临床评价动物个体健康状况的重要指标,是这2种珍稀濒危动物的繁殖生理及病理研究的关键资料,可为救援中心、动物园和其他机构的野外获救和人工圈养穿山甲的健康评估、疾病诊断提供参考依据.今后还将继续对更多野外获救穿山甲进行血液生理生化的检测,并进行性别、年龄及野外和圈养之间的比较研究,以补充穿山甲生理生化的基础资料.