水稻种子耐储藏性状QTLs挖掘及候选基因分析
2023-11-09钟芊芊黄佳慧殷文晶顾育嘉陈振概叶涵斐饶玉春
钟芊芊, 黄佳慧, 殷文晶, 芦 涛, 顾育嘉,陈振概, 叶涵斐, 饶玉春
(浙江师范大学 生命科学学院,浙江 金华 321004)
水稻(OryzasativaL.),禾本科稻属,1年生单子叶植物,是中国乃至世界上最重要的粮食作物之一.据国家统计局数据库显示,截至2020年全国稻谷产量约为2.1亿吨[1],为保证农业生产和粮食安全,需对水稻种子和稻谷进行储藏备用.水稻耐储藏性状是一种特殊的农艺性状,主要表现为稻米品质及稻种活性保存2个方面:作为稻米,长时间储藏后仍能保持稻米的原有品质及风味;作为稻种,长时间储藏后仍能保持较强的活力[2].我国每年稻谷存储量约占总产量的40%[3],但长时间的储藏往往造成种子活力下降、稻米品质劣变等问题,极大影响了粮食安全和水稻生产.研究表明,杂交稻种子储藏1年后发芽率下降幅度明显,且每年因储藏过程中的陈化变质、仓储害虫和霉变影响等造成的稻谷损失约占总储量的3.05%,经济损失超过200亿元,严重影响我国稻谷供需平衡[4-5].稻种品质与自身遗传因素与储藏时间、温度、湿度等外界条件密切相关.虽然建立低温、气调仓库等现代技术为种子的储藏创建了良好的设备条件,但储藏成本也随之增加[6],因此,目前最为经济有效的减少稻种储藏损失的方向之一是培育水稻耐储藏新品种,这对保障水稻种质资源具有极大的现实意义.
自2002年来,国内外学者采用不同的遗传群体逐渐开展在稻种耐储藏遗传方面的研究,研究人员分别采用各个影响水稻耐储藏特性的不同指标,挖掘到许多与稻种耐储藏性状相关的QTLs位点.其中,发芽率是体现稻种储藏能力最为直观的相关指标,且稻谷储藏时间的长短也会造成稻谷发芽率的差异.Miura等[7]利用Nipponbare/Kasalath回交群体,以种子发芽率为指标检测到3个与稻种耐储性相关的QTLs.Ngo等[8]使用Sasanishiki/Habataki//Sasanishiki回交自交系的发芽率来评估种子耐储性,重复检测到qSSh-2-1和qSSh-2-2.刘进等[9]选取LD5和ZYZ8杂交衍生出的重组自交系群体为实验材料,以在自然条件下储藏1年、2年、3年后的稻种发芽率为指标,共检测到17个相关QTLs,其中qSSC2,qSSC6,qSSC7和qSSC8均能调控不同储藏时段的发芽率.Jiang等[10]综合MT-RIL和DT-RIL 2套群体不同储藏期的发芽率,在MT-RIL和DT-RIL中分别检测出5个和3个与种子发芽能力相关的QTLs.除发芽率外,发芽力(发芽势和发芽指数)也是体现稻种耐储藏的1个重要指标.毛光锋[11]对扬稻6号/秀水134构建的群体的种子储藏15个月后进行人工老化,对其发芽率及发芽力数据进行分析,检测到7个与发芽率、9个与发芽势、8个与发芽指数有关的耐储藏QTLs.稻种活力的耐储藏性与稻种发芽力相关,而稻谷品质的耐储藏性跟黏滞性(包括峰值黏度、热浆黏度和冷胶黏度)有关,因此,黏滞性也常被作为检测稻谷耐储性的指标之一.鞠玉栋[12]利用H359/Acc8558杂交建立的重组自交群体,以发芽力和黏滞性作为指标,筛选到21个与稻种耐储藏性相关的QTLs.在这些常规的指标之外,电导率也常被用来评价水稻耐储藏特性[13-14].曹玉洁等[15]以秀水134和扬稻6号为亲本构建高代回交群体BC3F2,以电导率为指标进行检测分析,共得到16个QTLs.综合利用稻种的各项指标,曹玉洁[16]采用苏御糯和桂朝2号构建了BC3F9高代回交群体,测定其储藏6个月后的种子活力性状和稻谷品质性状,定位到分别控制发芽率、发芽势、发芽指数、电导率、平均发芽天数、脂肪酸值、丙二醛含量等指标的232个相关的QTLs位点.同时,费月新[17]分别利用以秀水120和扬稻6号构建互为轮回亲本的46个染色体片段代换系和以秀水134为轮回亲本的53个染色体片段代换系,通过对稻种的老化处理的实验研究定位到与电导率、发芽率、发芽力、平均发芽天数等多个指标相关的QTLs.以上结果挖掘了许多水稻耐储藏性状相关的QTLs位点,为培育耐储藏水稻新品种奠定了基础,但由于不同研究者所采用的材料群体、老化处理方式、检测指标等不同,因此,所定位到的结果可比性较低[18].
近年来,水稻产量连年增加,稻种储藏压力越来越大,每年因储藏带来的稻种损失也愈发严重[19],因此,研发和培育耐储藏水稻品种显得尤为重要.尽管目前已有较多的耐储藏研究理论及技术支持,但真正应用到水稻育种中的却少之又少,培育耐储藏水稻并投入生产实践应用仍具有一定的难度[20].本研究以HZ/Nekken2和TF/Nekken2构建的2套RILs群体为材料,通过检测稻种发芽率数据,对其数量性状位点进行定位分析,以期得到水稻耐储藏相关的QTLs位点或基因,为培育耐储藏水稻主栽品种提供理论基础和参考依据.
1 材料与方法
1.1 实验材料
本研究分别以HZ/Nekken2和TF/Nekken2为亲本杂交产生F1代,对其采用单粒传代套袋自交法至12代后分别得到基因型及表型均稳定遗传的120个RILs,构建2套RILs群体.HZ和TF均是优异的水稻育种材料,具有高产、稻米品质好及抗虫性强等特点,因此,具有较高的耐储藏研究价值.
1.2 实验方法
1.2.1 水稻种子整理
取分别储藏1年(2018年)及2年(2017年)的TF和HZ及其后代RILs群体中颗粒较为饱满、光泽度较好的水稻种子各100颗,明确其年份和品种类型,将其归类放入特制牛皮纸袋中进行保存.
1.2.2 浸种催芽
对水稻种子表面进行消毒,先用70%乙醇浸泡种子10 min,用去离子水冲洗后再用10%次氯酸钠浸泡种子30 min进行消毒,重复3次,最后用去离子水冲洗数次.将消毒后种子整理好浸于水中2 d,中途换1次水,使种子能更好地打破休眠、恢复活力.用湿毛巾包裹种子(以确保种子湿度)置于37 ℃培养箱催芽3 d[21],取出统计其发芽率.
1.2.3 测定双亲及后代株系的耐储藏性状
1)植株发芽率情况观察:以种子露白为发芽标准,每日观察稻种露白情况;2)稻种发芽率量化:精确统计各株系稻种的发芽数量,进行整理与计算.
1.2.4 遗传图谱构建
利用HZ/Nekken2和TF/Nekken2杂交产生的F1代通过单粒传法连续套袋自交至12代得到2套RILs群体.对2套RILs群体进行基因组测序,并对测序数据进行整理分析,从而获得均匀分布在12条染色体上的4 858个标记,构建重组自交系遗传图谱.
1.2.5 QTLs定位
在实验室前期构建的分子连锁遗传图谱基础上,对测得的发芽率数据通过复合区间作图法对数量性状座位区间进行作图分析[22],运用软件Mapmaker/QTL1.1B对耐储藏性状进行定位分析,设置LOD阈值为2.5.QTL的置信区间定义为LOD值大于M-1的区间.其中,M为LOD值峰值.若检测到LOD值大于2.5的分子标记,则认为LOD值最高处对应的2个标记区间内存在1个QTL.QTL的命名遵循Mccouch等[23]提出的原则.
2 结果与分析
2.1 双亲及RILs群体耐储藏的性状表现
统计各株系稻种发芽数量,经计算得到各株系种子发芽率.2套RILs群体分别储藏1年(2018年)、储藏2年(2017年)的种子发芽率及平均发芽率之比如图1所示.统计结果显示,HZ-RIL储藏1年、2年的平均发芽率分别为57.06%和15.10%,平均发芽率之比为0.26,均介于HZ与Nekken2之间.TF-RIL储藏1年、2年的平均发芽率分别为61.53%和20.03%,平均发芽率之比为0.36,均介于TF与Nekken2之间.2套RILs群体中储藏2年的种子发芽率均远低于储藏1年的种子发芽率,因此,种子储藏时间越长,发芽率就越低,越不利于稻谷储藏.HZ-RIL分别储藏2年、1年的平均发芽率均低于TF-RIL,因此,推测TF-RIL较HZ-RIL更耐储藏.2套RILs群体株系稻种发芽率均表现为连续正态分布,且有一定数量的超亲个体存在,表现出数量性状的遗传特点,符合QTLs区间作图需要.
A:HZ-RIL储藏1年的发芽率;B:HZ-RIL储藏2年的发芽率;C:HZ-RIL平均发芽率之比;
2.2 耐储藏性状QTLs定位分析
利用实验室前期已构建完成的RILs群体分子遗传连锁图谱对2套RILs群体的耐储藏形状进行QTLs检测分析(见表1和表2).对2套RILs群体储藏不同年份的发芽率及其比率数据进行QTLs检测分析,共在20个位点上检测到对应QTLs,分布于水稻第1,2,4,6,8,9,10和11号染色体上(见图2).
表1 HZ-RIL耐储藏QTLs分析
表2 TF-RIL耐储藏QTLs分析
图2 重组自交系耐储藏性状的QTLs位置分布
HZ-RIL中检测到10个QTLs,分别位于第1,2,4,6,8,10号染色体上,有6 个阈值较大的QTLs位点LOD值超过了3.50,其中,位于8号染色体103.52~103.81 cM区间内LOD值高达5.48,物理距离为67 kb.在TF-RIL中,共检测到10个QTLs,第4,8,9,10号染色体上各1个,11号染色体上2个,2号染色体上4个.其中,2个贡献率较大的QTLs,1个位于2号染色体115.13~122.18 cM上,阈值为2.79,物理距离约为1 645 kb,另外1个在4号染色体上41.37~51.16 cM,阈值最大为2.76,物理距离约为2 284 kb.
2.3 耐储藏性状候选基因分析
通过水稻基因组注释网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)对上述QTLs所在区间进行候选基因的表达分析,查阅相关文献,共筛选到可能与水稻耐储藏性状相关的11个候选基因,分布于第1,2,4,6,10号染色体上(见表3).其中,候选基因LOC_Os02g03060及LOC_Os06g11500为前人已经研究克隆过的基因,其余9个为尚未报道克隆的基因.在11个候选基因里,编码赤霉素受体GID1L2及脂肪酶的各有2个.LOC_Os06g11130和LOC_Os06g11135编码赤霉素受体GID1L2,均位于6号染色体上;LOC_Os01g15000及LOC_Os04g56240编码脂肪酶,分别位于第1,4号染色体.前人发现,赤霉素受体GID1L2及脂肪酶在稻谷储藏期间均会影响其耐储性.赤霉素具有打破种子休眠,促进种子发芽的作用[24-25],赤霉素受体GID1L2在赤霉素信号转导过程中发挥着重要作用,从而影响水稻种子的耐储性[26].稻谷在储藏时其脂质成分稳定性较差,脂质的水解氧化会降低水稻种子的品质[27],脂肪酶活力与种子活力呈负相关[28-29].
表3 耐储藏性状候选基因及功能注释
3 讨 论
水稻的耐储藏性状较为复杂,由多个基因共同控制数量性状,表达性状易受多种因素的影响,实验过程中选取的水稻群体不同、生长环境不同、处理方法不同等,都会影响其QTLs定位的结果.稻谷的耐储藏性关乎国家粮食安全,但对水稻耐储性的相关研究仍不够深入.本研究利用HZ-RIL和TF-RIL 2套群体对水稻耐储藏性状进行QTLs位点挖掘,总结如表1和表2所示.
本研究在1号染色体的32.09~40.14 cM上成功定位到LOD值达3.50的QTL位点,该位点与费月新[17]在1号染色体上的RM259(38.8 cM)检测到的控制电导率的QTL存在重叠,说明该区域很可能存在控制水稻耐储藏性状的基因,具有较大研究价值.在2号染色体的64.85~65.18 cM和66.45~67.74 cM处所定位到的2个QTLs位点,与Ngo等[8]在2号染色体R1843~R26标记区间内定位到的QTL极为相近,证明该区域附近可能存在调控水稻耐储藏性状的主效QTL.在9号染色体的49.89~57.81 cM上定位到的QTL与毛光锋[11]和费月新[17]同时在9号染色体RM434(56.7 cM)处检测到的QTL位点重叠,由此推测,此区域极大可能存在1个控制水稻耐储藏特性的多效位点.11号染色体上定位到2个QTLs位点,其中位于122.91~123.59 cM的QTL与费月新[17]定位得到的与发芽率、平均发芽天数相关的QTL位点(123.5 cM)相近,推测该区域附近存在与水稻耐储藏性状相关的QTL位点.
除此之外,本研究还得到了许多新的QTLs位点,所定位到QTLs位点较多分布于2号染色体上,其中,在4.66~5.57 cM处的1个QTL位点LOD值较高,为3.95.在4号染色体上定位到4个QTLs位点,在12.63~16.49 cM和18.10~20.00 cM处分别检测到LOD值为4.20和3.21的QTLs位点,效应值均较大且物理距离相近,推测该区域附近存在控制水稻耐储藏性状的基因.6号染色体上检测到的2个QTLs位点距离较为接近,但LOD值均不高,猜测此区域附近可能存在控制多种性状的多效基因.在8号染色体的103.52~103.81 cM处检测到1个QTL,LOD值高达5.48,效应值较大,但此前还没有8号染色体上耐储藏QTL的相关报道,因此,猜测此处可能是未被发现的耐储藏QTL,可利用这段QTL区间进行水稻品种关于耐储藏性状的改良.10号染色体上检测到2个QTLs,其中在80.18~80.47 cM处存在1个LOD值超过4的QTL区间,说明该区间内很可能存在1个控制稻种耐储藏的主效基因.
本研究对检测到的QTLs区间内的所有基因进行筛选梳理,筛选得到11个可能与稻种耐储藏性状相关的基因(见表3).其中LOC_Os01g15000和LOC_Os04g56240编码脂肪酶,参与调控脂质氧化反应,许惠滨等[32]发现稻谷脂肪酶与脂质的直接接触会导致脂肪水解氧化,从而使稻种活力丧失、米质劣变,龚继平[33]进一步研究表明,种胚脂肪酶活性低的水稻种子较耐储藏,因此证明,脂肪酶对稻谷的耐储性具有至关重要的作用.LOC_Os01g14670基因编码的Cupin蛋白结构域为一种类萌发素蛋白,研究表明该蛋白具有SOD和AGPase活性,调控植物胚的发育[34],若萌发素类基因大量表达,则发芽率明显提高,不利于种子的储藏.LOC_Os02g03060编码细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶,其广泛参与种子萌发过程[30],主要是通过动员种子内的贮存蛋白来实现氮素的再次利用[35],以供种子萌发所需;LOC_Os06g11050编码细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂,因此,该基因也参与水稻种子耐储藏性状的调控.LOC_Os01g16470编码的磷脂酰肌醇激酶参与质膜磷脂的分解与代谢,而质膜磷脂的缺失可以降低脂类的氧化损伤,防止种子油脂的分解[36],从而提高种子的耐储藏性.LOC_Os06g11130和LOC_Os06g11135编码赤霉素受体GID1L2,其在赤霉素信号转导过程发挥着重要作用,而赤霉素能打破种子休眠从而促进种子发芽[24-25],因此会影响水稻种子的耐储性[26].LOC_Os06g10790编码凝集素样受体激酶,其有助于种子的萌发[37].LOC_Os06g11500编码水稻微型染色体维持蛋白基因,其影响细胞周期进程,从而影响着水稻的耐储藏能力[31].LOC_Os10g11750编码LTPL89-蛋白酶抑制剂,其在水稻种子发育与萌发过程中发挥重要功能[38].综上,这些候选基因为进一步验证水稻耐储藏基因的功能及分子育种实践提供了物质基础,对水稻品种的提升具有重要的意义.
水稻耐储性受多个不同数量性状共同影响,具有一定复杂性.本研究通过挖掘水稻种子耐储藏性状QTLs和候选基因分析,为今后分子标记辅助选择育种等奠定基础,从而可以有目的、有方向地培育出耐储藏、发芽率高的水稻新品种并投用于水稻的生产与储藏.
4 展 望
研究水稻的耐储藏性状对国家粮食安全具有重要意义,因此,如何培育优质耐储藏的水稻品种将成为众多水稻育种工作者致力攻克的难题.本研究以稻种发芽率为检测指标,以期通过挖掘水稻种子耐储性相关QTLs和筛选候选基因的方式,深入探究稻种耐储藏性状相关基因的调控机制.本研究所检测到的QTLs位点较多,后续可对其中个别效应值较大的QTLs位点进行精细定位并进行多环境重复验证,同时对筛选到的候选基因进行qRT-PCR分析,结合基因组测序等手段,以期找到调控水稻耐储藏性状的基因.