基于网络药理学和分子对接探究文旦柚皮精油的主要功效

曾丽兰， 朱麒靖， 朱 萍， 刘小英， 吴碧君， 周北斗

( 1. 莆田市农业科学研究所， 福建 莆田 351100；2. 仙游县农业农村局， 福建 仙游 351200；3. 莆田学院 药学与医学技术学院， 福建 莆田 351100 )

0 引言

柚子， 又名文旦、 香栾等， 英文名shaddock，是芸香科植物柚的成熟果实。 文旦柚原产福建，是福建省特有的名贵果品之一， 果实品质优良，尤以莆田市仙游县度尾镇所产的文旦柚最为著名， 具有肉嫩汁醇、 气味芳香等特点[1]。 文旦柚分为红肉与白肉两个品系， 果肉含有维生素C、 挥发油和糖类等成分， 具有抗炎、 止咳和降血压等作用[2]。 文旦柚皮含有柚皮苷、 香精油等， 具有止咳、 化痰、 抗炎等功效[3]， 还具有暖胃、 润喉的食疗作用， 将其熬汤后还具有美肤的功效[4]。 同其他产地的文旦柚相比， 莆田产文旦柚的柚皮所占比例较大[5]， 具有开发价值。 本文利用网络药理学和分子对接探究莆田产文旦柚皮精油的主要功效， 为其开发提供理论参考。

1 方法

1.1 收集与筛选活性成分

选取报道文旦柚皮精油化学成分的文献， 在PubChem 数据库(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查询这些成分的化学结构， 在SwissADME数据库(http:∥www.swissadme.ch/)查询这些成分吸收、 分布、 代谢和排泄过程， 选取胃肠道吸收为高且类药性参数至少有2 个Yes 的成分作为研究对象。

1.2 预测靶点

在SwissTargetPrediction 数据库(http:∥www.swisstargetprediction.ch/)和PharmMapper 数据库(http:∥www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)预测化合物的靶点， 并在UniProt 数据库(https:∥www.uniprot.org/)将靶蛋白的名称转为规范的基因名称。

1.3 构建蛋白相互作用网络(PPI)图与筛选主要靶点

在String 数据库(https:∥cn.string-db.org/)构建PPI 数据库， 然后导入Cytoscape 3.7.2 软件， 运用Network analyzer 插件进行网络特征的分析， 并对靶点的PPI 图进行可视化处理。 根据相关拓扑参数， 筛选出主要靶点。 最后， 利用该软件构建主要靶点的网络图。

1.4 主要靶点的富集分析

使用Metascape 数据库(https:∥metascape.org/gp/index.html＃/main/step1)进行主要靶点的富集分析， 包括基因本体(GO)富集分析、 京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。GO 分析对象包括生物过程(BP)、 细胞成分(CC)和分子功能(MF)3 个方面。

1.5 分子对接

将各成分的Mol2 格式依次导入Sybyl-x 2.0软件， 优化构象。 利用Sybyl-x 2.0 软件进行构象优化时， 最大迭代次数和终止的差值分别设置为10 000 和0.005， 力场设置为Tripos， 电荷选Gasteiger-Hückel。 从PDB 数据库(https:∥www.rcsb.org/)下载经过实验验证的人类核心靶蛋白(以下简称核心靶蛋白)。 利用Sybyl-x 2.0 软件的Surflex-Dock 模块将各成分的Mol2 文件与核心靶蛋白对接， 获取对接总分、 碰撞值、 相似度和综合分数等参数， 然后评估各成分和核心靶蛋白的结合情况。

1.6 构建活性成分和主要靶点的网络图

根据分子对接结果， 确定与核心靶点较强烈或者强烈结合的活性成分， 建立活性成分-核心靶点数据集， 利用Cytoscape 3.7.2 软件构建网络图。 根据KEGG 通路分析结果， 建立核心通路和主要靶点的数据集， 然后构建网络图。

2 结果

2.1 活性成分收集与筛选结果

卢锦澜等报道了6 个产地文旦柚皮精油化学成分， 6 种文旦柚皮精油大部分化学成分相同，仅有少数化学成分有差异[6]。 从研究地域考虑，本文选取莆田产文旦柚皮精油为研究对象， 将其化学成分的CAS(Chemical Abstracts Service)编号导入PubChem 数据库， 下载这些成分的Sdf(Structure Data File)格式的化学结构并导入Swiss ADME 数据库， 筛选出28 个胃肠道吸收为高且类药性参数至少有2 个Yes 的成分(见表1)作为研究对象。

表1 筛选到的化学成分

2.2 靶点预测结果

将表1 中28 种化合物的结构导入SwissTargetPrediction 数据库， 选人类， 选取概率大于0的靶点。 CF2 未能在SwissTargetPrediction 数据库预测到靶点， 故CF2 仅在PharmMapper 数据库预测人类的靶点蛋白质[7-9]。 在Uniprot 数据库将靶点蛋白质名称转为规范的基因名称。 将所有成分的靶点汇总， 去掉重复项， 得到621 个靶点。

2.3 PPI 图和主要靶点筛选结果

将上述621 个靶点导入String 数据库， 选择经过实验验证且置信分数＞0.4 的人类蛋白质。蛋白质相互作用图含有489 个节点和4 450 条边(图1)。 将所得数据导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建靶点的PPI 图， 然后计算度值、 紧密中心性和中介中心性等参数， 用以筛选主要靶点。 这3个参数数值越大说明该节点在网络中越重要[10]。根据这3 个参数对靶点进行排序， 结果大致相同。 这3 个参数均大于平均值的109 个靶点被确认为主要靶点(图2)， 其中度值排名前10 位的靶点被确认为核心靶点。

图1 靶蛋白相互作用图

图2 109 个主要靶点的网络图

2.4 GO 和KEGG 通路富集分析结果

使用Metascape 数据库对上述109 个主要靶点进行富集分析， 包括GO 和KEGG 通路分析，见图3～图6。 条形图越长代表P值越小， 说明实验组和对照组的差别越有统计学意义， 限于篇幅， 图3～图6 中只列出P值较小的前10 位。

图3 GO 的BP 分析

图4 GO 的CC 分析

图5 GO 的MF 分析

图6 KEGG 通路分析

总共得到177 条KEGG 通路， 其中排在前10 位的KEGG 通路依次简称为TL1～TL10。

2.5 分子对接结果

对接总分(TS)越大， 配体和受体的结合情况越好。 当5 分≤TS＜7 分时， 表明相应的成分和核心靶蛋白可以较强烈地结合； 当TS≥7 分时， 表明相应的成分和核心靶蛋白可以强烈地结合[11]。 核心靶蛋白与各成分依次进行对接验证，CF1 ～CF2、 CF5 ～CF8、 CF10、 CF12 ～CF22 和CF24～CF28 共23 个成分与核心靶蛋白产生较强烈的结合， CF10、 CF18 ～CF19、 CF21 ～CF22、CF24～CF25 和CF27～CF28 共9 个成分与核心靶蛋白产生强烈的结合(表2)。 特别是， CF27 与8种核心靶蛋白产生强烈的结合， CF28 与4 种核心靶蛋白产生强烈的结合。 表2 中， 提取码指从PDB 数据库下载的核心靶蛋白的编码， 配体指分子对接时从核心靶蛋白提取的配体。

表2 与10 个核心靶蛋白较强烈或强烈结合的成分

由表2 可以看出大多数成分能起作用， 而且CF27/28 等是关键成分， 其与部分核心靶蛋白的对接数据见表3。 同时满足TS≥8 分、 碰撞值的绝对值≤4 和综合分数≥4 分的对接被认为配体和受体具有良好的亲和力。 表3 中， 第2 ～3、5～6和9～10 行的对接会产生良好的亲和力。

表3 CF21/22/27/28 和部分核心靶蛋白的对接数据

以CF27 和去除配体A/Z00-1441 的蛋白2XYJ 的对接为例。 CF27 的酯基的羰基的氧原子和蛋白2XYJ 的A 链的307 号的天冬酰胺的氨基上的氢原子形成氢键， 其长度为2.11Å(图7)。

图7 CF27 和去除配体A/Z00_ 1441 的蛋白2XYJ 的三维图和氢键连接图

2.6 活性成分和主要靶点的网络图

根据表2， 用Cytoscape 3.7.2 软件构建10 个核心靶点及其对应的23 个活性成分的网络图， 其中八边形代表核心靶点， 菱形代表活性成分(图8)。

图8 核心靶点和活性成分的网络图

通过KEGG 通路分析， 发现10 个核心通路对应58 个主要靶点， 其中包含10 个核心靶点。用Cytoscape 3.7.2 软件构建核心通路和58 个主要靶点(含10 个核心靶点)的网络图， 其中三角形代表核心通路， 八边形代表核心靶点， 长方形代表非核心的主要靶点(图9)。

图9 核心通路和主要靶点的网络图

3 讨论

由表1 可见， 文旦柚皮精油含有乙酸己酯、芳樟醇、 香茅醛、 吲哚、 香茅醇乙酸酯、 十六烷酸甲酯和香叶芳樟醇等芳香性成分， 因此文旦柚皮精油可用于制作日用品、 食品、 保健品和医药品等。

由图9 可见， TL1 涉及HSP90AA1、 ESR1、EGFR、 CCND1、 SRC、 MAPK1、 MAPK3、 AR、CACNA1B、 CDC25A 等18 个基因， 其中前面7个为核心靶点。 由表2 和图8 可见， 能与该通路至少5 个核心靶点产生较好结合的成分有CF1/2/5/8/10/12/14/16/18/19/21/22/24/25/27/28。其一， 热射蛋白90(HSP90)AA1 作为一种肿瘤蛋白， 可调节目标蛋白的组装、 操作、 折叠和降解[12]。 其二， 在肝癌细胞中SRC 对于成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)信号复合物的内体传递至关重要， 因此SRC 抑制剂有望用于治疗FGFR4 被激活产生的肝癌[13]。 其三， 在临床的前列腺癌组织中MiR-378 的表达明显下调， 过度表达MiR-378 可抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭，进而促其凋亡， 进一步地， MAPK1 被确定为MiR-378 的直接靶标[14]。 可见， MAPK1 是潜在的治疗人类前列腺癌的靶点。 因此， 文旦柚皮精油通过作用于HSP90AA1、 SRC 和MAPK1 等基因， 可起预防化学物质致癌的作用。

由图9 可见， TL4 涉及MAPK1、 MAPK3、PTGS2、 CACNA1B、 CDK5、 CHRM1、 GRIN2B、GRM1、 GRM5 等21 个基因， 其中前面3 个为核心靶点。 由表2 和图8 可见， 与这3 个核心靶点能产生较好结合的成分有CF10/16/22/25。 阿尔兹海默症(Alzheimer's disease， AD)常起病于老年或老年前期， 多缓慢发病， 逐渐发展， 以痴呆为主。 Chen 等通过 Meta 分析发现 ABCA1 rs2422493 多态性是一种发生AD 的风险因素，然而PTGS2 rs20417 变异型具有降低AD 风险的作用[15]。 因此， 文旦柚皮精油通过作用于PTGS2 等基因起到预防AD 等神经退行性病变的作用。

由图 9 可见， TL5 涉及 HSP90AA1、MAPK1、 MAPK3、 PPARG、 SRC、 CXCL1、CYP2A6、 CYP2C9、 GSK3B、 MAPK14 等16 个基因， 其中前面5 个为核心靶点。 由表2 和图8可见， 与这5 个核心靶点能产生较好结合的成分有 CF8/10/12/14/16/18/21/22/24/25。 其一，在巴西人口的大样本中发现超重与肥胖与4 个基因的变异相关， 分别是PPARG(rs1801282)、PPARGC1A(rs8192678)、 FTO (rs9939609) 和MC4R(rs17782313)， 其中PPARG 是超重和肥胖最强的相关基因[16]。 其二， Chen 等发现MiR-128-3p 通过作用于PPARG 和SERTAD2 阻碍3T3-L1 的脂肪生成， 从而阻碍前脂肪细胞的分化， 并促进脂肪分解[17]。 因此， 文旦柚皮精油可以通过作用于PPARG 等基因起到降低高血脂和减缓动脉粥样硬化的作用。

生活中柑橘类水果的果皮常被当作废物丢弃。 从农产品的废弃物开发出增值产品是处理农业废弃物的一个新兴方法。 柑橘皮富含精油， 对一部分昆虫有毒性。 文旦柚皮精油通过接触和熏蒸对害虫显示潜在的毒性作用， 能杀灭三带喙库蚊和埃及伊蚊的幼虫， 然而对贮藏种子的萌发未见明显抑制作用。[18]因此， 文旦柚皮精油还有望被开发成为生物杀虫剂。

本文推断的文旦柚皮精油的主要药理学机制和功效为其开发提供了理论参考， 但还需实验验证。