海南火山金钗石斛不同部位的红外光谱法结构解析

韩筱,艾益静,陈昱学,戴军,张晓萍,孙伟*

(1.海南师范大学 化学与化工学院,海口市功能材料与光电化学重点实验室,海南 海口 571158;2.皖西学院 生物与制药工程学院,安徽 六安 237012;3.海南胜嵘生物科技有限公司,海南 海口 571157)

石斛属多年生草本植物,多生长在悬崖峭壁背阴处的石缝里。我国海南是石斛主要产地之一。石斛素有“救命仙草”的美誉,俗称“药黄金”,其性寒、味甘、淡、微咸,有滋阴清热、益胃生津的疗效[1]。现代药理学表明[2],石斛具有增强免疫力、抗肿瘤、抗衰老和抗血小板凝集等作用。石斛化学成分多且复杂,目前确定含有的成分有生物碱类、菲类、联苄类、氨基酸类、微量元素及多糖类等[3-6]。海南火山金钗石斛生长在海口火山岩上,独特的生态环境和火山岩地貌,造就了火山石斛的独特品质,长期适量服用,能强身健体,调节免疫、延缓衰老。药用石斛的市场需求量也比较大[7]。由于石斛属植物品种众多,供药用的仅有39种[8],非药用与药用石斛从外观上难以区分[9],同一石斛不同生长年限不同部位其药用成分的含量也不尽相同,不良商家常将非药用石斛混入药用石斛,导致石斛市场以假乱真的现象普遍发生,石斛产业标准混乱、品质参差。因此亟待寻求一种快速有效鉴别石斛的方法。

目前对石斛属药用植物的鉴别法主要有性状鉴别法[10]和色谱法、脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)分子标记鉴定等方法[11],第一类方法需要有丰富的性状鉴别技术与经验,主观性强,不够准确,第二类方法除红外光谱法外,对样品前处理都比较复杂。傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infrared Spec-troscopy,FTIR)是一种传统的化合物分子结构分析手段,它是鉴别不同化合物、确定分子结构的常用方法,任何气态、液态、固态样品均可用红外光谱进行测定[12]。红外光谱技术已经在医药、食品、化工等领域广泛应用[13-15],该技术应用在中药材的鉴定不仅能够准确迅速地反应药材的整体特征,而且简单方便,用样量少且绿色环保,近年来在中药鉴别研究中的应用受到越来越多的关注[16]。邓月娥等[17]对不同产地金钗石斛进行红外光谱解析,证实了红外光谱法对于快速判定金钗石斛的产地是可行的。李兆奎等[18]采用红外光谱法对铁皮石斛和几种常用的混淆品进行对比分析,可快速准确地将其区分开来。

本文采用红外光谱及二阶导数谱对海南火山金钗石斛的不同部位进行红外光谱测试,分析其不同部位的主要活性成分及其含量,为火山口地区石斛的品质和采收部位提供理论依据,以期能为石斛药材定性分析和活性鉴定提供一种新方法和新思路。

1 实验部分

1.1 仪器试剂

Avatar 360 傅立叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司),测定范围4 000～400 cm-1,DTGS检测器,光谱分辨率4 cm-1,扫描信号累加次数32次,扫描时实时扣除H2O和CO2的干扰;中药粉碎机。

溴化钾(KBr,光谱纯)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 石斛样品制备

海南火山金钗石斛新鲜植株和商业石斛干粉均由海南胜嵘生物科技有限公司提供。将新鲜的石斛根、茎、叶洗净后烘干并分别剪成小段,置于60 ℃干燥箱内烘至恒重,用中药粉碎机粉碎成粉末。过200目(筛孔孔径:0.075 mm)筛后分装于不同的试管中备用。

1.3 红外光谱分析

取少量不同部位的火山金钗石斛粉末和商业石斛干粉分别与溴化钾粉末混合,倒入玛瑙研钵中研磨均匀并压片,将所有的压片放置于傅里叶红外光谱仪上扫描,进行压片测试。红外图谱使用Nicolet omnic 9.2操作软件,对得到的样品进行数据采集及图谱预处理,预处理过程包括基线校正(Baseline automatic correction)和比对(Compare):二阶导数谱使用Nicolet omnic 9.2操作软件。

2 结果与讨论

2.1 各部分的实物图

海南火山金钗石斛叶片、茎干、根须及商业石斛干粉的照片如图1所示。所使用的干粉为市售商品,外观干燥蓬松呈浅黄色,不同部位的石斛均在新鲜健康植株上收集,叶肉饱满,茎干粗壮,根须发达。

图1 海南火山石斛干粉(a)、叶片(b)、茎干(c)、根须(d)照片

2.2 各部分的一维红外光谱图

分别对海南火山石斛商业干粉及新鲜植株上叶片、茎干、根须部位处理后得到的样品进行溴化钾压片,得到海南火山石斛各部分的一维红外光谱图,如图2所示。

图2 海南火山石斛干粉(a)、叶片(b)、茎干(c)、根须(d)的一维红外光谱图

在红外光谱图中可以看出,海南火山石斛不同部位的一维红外光谱特征吸收峰有共性也有差异。共性是不同石斛样品谱图形状非常相似,四个样品多个吸收峰的位置和强度基本一致,吸收峰位置只相差几个波数。例如石斛干粉3 413.93 cm-1、石斛叶片3416.97 cm-1、石斛茎干3422.08 cm-1与石斛根须3 419.50 cm-1相差3～9个波数;石斛干粉2 922.87 cm-1、石斛叶片2 923.06 cm-1、石斛茎干2 924.59 cm-1与石斛根须2 922.64 cm-1相差1～2个波数,四个样品具体的吸收峰位置见表1。因此要区分四者还需要分辨率更高的二阶导数图谱或者二维相关的红外光谱。差异主要是一些特征峰强度不同,如峰1(1 628 cm-1附近峰)和峰2(1 050.98 cm-1附近峰)相对强度不同。石斛干粉样品峰1明显弱于峰2;石斛叶片样品峰1强于峰1;石斛茎干样品和石斛根须样品峰1和峰2强度相似。

表1 不同火山石斛部位一维红外光谱图特征峰出峰位置

四个样品均表现了C-O伸缩振动吸收峰,石斛干粉在1 153.37,1 050.98 cm-1位置,石斛叶片在1 062.00 cm-1位置,石斛茎干在1107.41,1064.99 cm-1位置,石斛根须在1106.64,1 057.40 cm-1位置。石斛干粉、石斛叶片、石斛茎干和石斛根须也表现了C-H弯曲振动吸收峰,石斛干粉在1 425.54,1 375.87,1 325.53 cm-1,石斛叶片在1 423.36,1 321.71 cm-1,石斛茎干在1 460.37,1 424.61 ,1 382.43,1 321.10 cm-1,石斛根须在1 459.13,1 425.90,1 380.38,1 322.56 cm-1。石斛干粉、石斛茎干和石斛根须表现了芳环骨架C=C伸缩振动吸收峰,该峰指示了芳香类成分的存在,石斛干粉在1 513.10 cm-1附近,石斛茎干在1 511.39 cm-1附近,石斛根须在1 512.90 cm-1附近。脂类的三个特征吸收峰在2 926,2 854,1 745 cm-1处,其中2 926 cm-1为亚甲基-CH2伸缩振动,2 854 cm-1为亚甲基-CH2伸缩振动,1738 cm-1为酯羧基C=O伸缩振动,淀粉的特征吸收峰为1 155,1 080 cm-1和1 019 cm-1,四个样品的一维红外光谱均有所体现,表明四个样品中都含有淀粉类和脂类成分以及芳香类成分,但峰的强弱不同,证明石斛的不同部位其药用成分的含量有所差别。

2.3 各部分的二阶导数光谱图

二阶导数谱可以把重叠的一维红外光谱峰分开,进而提高谱图分辨率,更加准确的显示吸收峰的位置,对商业石斛干粉红外光谱二阶求导,得到其二阶导数红外光谱图,如图3所示,在1 000～2 000 cm-1波段范围内,商业石斛干粉的特征吸收峰在1 739.60,1 159.83 cm-1处有较强峰,1 159.83 cm-1处为最强峰,其余位置为若干弱峰。石斛叶片的特征吸收峰在1 740.29,1 624.07,1 462.52,1 163.34 cm-1处有较强峰,其余为若干弱峰。石斛茎干均为较弱的峰。石斛根须有3个较强峰,分别在1 740.05,1 509.30,1 162.63 cm-1处,1 509.30 cm-1处为最强峰。在2 500～4 000 cm-1波段范围内,商业石斛干粉有2个较强峰,分别在2 852.47,2 922.75 cm-1处,其中2 922.75 cm-1处为最强峰,其他位置还有弱峰若干。石斛叶片有2个较强峰,分别在2 921.891,2 852.16 cm-1处,其中2 921.89 cm-1处为最强峰,其他位置还有弱峰若干。石斛茎干和根须均为若干弱峰。具体的出峰位置如表2所示。

图3 海南火山石斛干粉(a)、叶片(b)、茎干(c)、根须(d)的二阶导数红外光谱图

表2 不同火山石斛部位二阶导数光谱图特征峰出峰位置

以商业石斛干粉的二阶导数红外光谱为例,在1000～2000 cm-1波段范围的一维红外光谱中只出现9个吸收峰,但是在二阶导数光谱中有11个吸收峰出现。这是因为对一维红外光谱进行二阶求导后,一些被强吸收峰覆盖的弱吸收峰都显现出来,使石斛不同部位的原始红外光谱图特征峰的差异更加明显。四个样品的二阶导数谱在1 740,1 658 cm-1附近为非共轭C=O伸缩振动吸收峰,在1 559,1 503 cm-1附近出现芳香环骨架伸缩振动峰,在1 318 cm-1和782 cm-1附近出现强弱不同的草酸钙的特征峰,表明四个样品中均含有不同含量的草酸钙成分。

3 结论

从海南火山石斛商业干粉、叶片、茎干、根须的一维红外光谱分析可得,石斛干粉、叶片、茎干、根须含有多种相似的特征峰,如1 000～1 200 cm-1波段内的C-O 伸缩振动特征峰,1 300～1 475 cm-1波段内的C-H弯曲振动吸收峰,1 513.10 cm-1附近的芳环骨架C=C伸缩振动吸收峰以及亚甲基-CH2伸缩振动、亚甲基-CH2伸缩振动、酯羧基C=O伸缩振动等,说明四个样品中都含有淀粉、多糖、脂类成分和芳香类成分等活性成分,但是含量有所差别。二阶导数谱可以把一维红外光谱重叠峰区分开,将较弱的峰进一步分辨出来,通过二阶导数光谱分析不仅验证了以上研究结果,也在四个样品中发现了一维红外光谱难以发现的草酸钙成分。红外光谱分析法不仅用样量少、消耗化学试剂少,而且更加简便快速,能够在整体上反应石斛的质量。本文利用红外光谱和二阶导数谱得到海南火山石斛商业干粉、叶片、茎干、根须的结构信息,分析了海南火山石斛不同部位所含活性物质的差异,证明红外光谱解析方法非常适用于鉴定石斛这类种类较多且极易混淆的中药材,不仅对于探究高效快速的石斛鉴定方法有非常重要的意义,为石斛品质控制提供了参考依据,也为其他易混淆中药的鉴别提供了新的思路。