响应面法优化款冬花总黄酮提取工艺研究

郭靖,张丽,王纪清,白文轩

(衡水学院 化工学院,河北 衡水 053000)

款冬花(FarfaraeFlos)又名款花、九九花,俗称连三朵,是菊科植物款冬(TussilagofarfaraL.)的干燥花蕾,其性辛、温、味微苦,归肺经,具有润肺下气、止咳化痰之功效,常用于治疗新旧咳嗽、喘咳痰多和劳嗽咳血等病症[1]。现代研究表明款冬花主要含有黄酮类、萜类、有机酸类、生物碱类、多糖类、挥发油类等生物活性成分[2],具有镇咳祛痰、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、神经保护等药理作用[3]。黄酮类化合物具有优良的抗炎、抗氧化作用,在食品、药品、化妆品领域具有极广泛的应用。刘彩红等[4]研究结果表明款冬花中的黄酮化合物对自由基有较好的清除作用,可作为潜在的抗氧化活性的天然产物。本文以款冬花为原料,利用响应面Box-Behnken Design中心组合设计对其总黄酮的提取工艺进行优化,通过回归方程探究最优提取工艺条件,并研究影响因素对款冬花总黄酮含量的交互作用,以期为溶剂浸提款冬花总黄酮的产业化研究提供数据基础。

1 实验部分

1.1 原料、试剂与仪器

722紫外分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)、 恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)、Re-2000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器公司)、芦丁(中国药品生物制品检定所)、硝酸铝(天津市大茂化学试剂厂,分析纯)、亚硝酸钠(天津市大茂化学试剂厂,分析纯)、氢氧化钠(天津市大茂化学试剂厂,分析纯)、无水乙醇(天津市河东区红岩试剂厂,分析纯);款冬花(购于安徽亳州市佰林堂药业有限公司)

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线绘制

准确移取0.1 mg/mL芦丁溶液0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL分别于10 mL容量瓶中,分别加入0.30 mL 5%亚硝酸钠溶液,3 min后加入0.3 mL的10%硝酸铝溶液,静置6 min后加入4 mL的10%氢氧化钠溶液,用蒸馏水定容,摇匀放置15 min后于最大吸收波长507 nm处测定吸光度。以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,拟合得芦丁标准曲线方程:y=0.970 9x+0.012 9,相关系数R2=0.999 1,范围为 0～50 μg/mL。

1.2.2 款冬花总黄酮的含量测定

精确称取款冬花1.00 g,加入一定浓度的乙醇溶液,在一定温度和料液比下,加热回流一段时间,过滤得滤液,将滤液定容至一定量体积。取一定体积样品溶液稀释后,按1.2.1法测定吸光度,根据芦丁标准曲线,计算款冬花的总黄酮含量(mg/g)。

1.2.3 单因素实验设计

精确称量1.00 g款冬花,采用乙醇回流浸提法,分别考察乙醇体积分数 (50%,60%,70%,80%,90%)、料液比1∶25,1∶30,1∶35,1∶40,1∶45(g∶mL)、提取时间 (60,90,120,150,180 min)、提取温度 (50,60,70,80,90 ℃)四个变量对款冬花总黄酮的提取含量影响。

1.2.4 响应面实验设计

在单因素试验基础上,筛选出款冬花总黄酮含量影响较大的三个因素,采用响应面设计实验共29组,以款冬花的总黄酮含量为响应指标,探讨各变量及其相互作用对提取总黄酮含量的影响。表1显示中心组合设计各变量水平。

表1 响应面实验设计因素与水平

2 结果与讨论

2.1 单因素实验对总黄酮含量的影响

2.1.1 乙醇浓度对总黄酮含量的影响

从图1可知,随乙醇浓度的增加,款冬花总黄酮含量先升后降。当乙醇体积分数为60%,总黄酮含量最高为50.10 mg/g。可能是由于乙醇体积分数增加,黄酮类化合物在醇溶液中溶解增大,60%醇溶液使黄酮溶解度达最大,随乙醇浓度继续增加,醇溶性杂质溶出量增大,与黄酮类物质竞争溶出,使总黄酮类化合物含量降低。故本实验选择乙醇体积分数为50%～70%范围内比较合适。

图1 乙醇浓度对总黄酮含量的影响

2.1.2 提取温度对总黄酮含量的影响

由图2可知,提取温度与款冬花总黄酮含量成正相关,当提取温度为80 ℃时达最高值49.90 mg/g。继续升温至90 ℃时,总黄酮含量却略有降低,原因可能是由于高温导致热敏性黄酮化合物降解,从而使总黄酮含量降低。故提取温度选择70～90 ℃为优化实验范围。

图2 提取温度对总黄酮含量的影响

2.1.3 提取时间对总黄酮含量的影响

由图3分析可知,随提取时间的增加,款冬花总黄酮含量先升后降。当提取时间150 min时,款冬花总黄酮含量达最高,为49.57 mg/g。因此优化实验的提取时间范围为120～180 min。

图3 提取时间对总黄酮含量的影响

2.1.4 液料比对总黄酮含量的影响

由图4可知,当料液比处于 1∶40 mL/g 时,款冬花总黄酮含量达到峰值,液料比继续增大,总黄酮含量开始降低。可能的原因是当溶剂量过小时,较少的提取溶剂不能够将款冬花完全浸湿,总黄酮溶出不彻底; 随着液料比的增加,总黄酮开始溶出彻底,总黄酮含量迅速增加。当溶剂量过多时,款冬花的其他溶质开始析出,款冬花中总黄酮含量减少了。故将液料比在 1∶35～1∶45(g∶mL)作为优化试验的范围。

图4 液料比对总黄酮含量的影响

2.2 响应面实验结果与分析

响应面实验设计方案与实验结果见表2。

表2 响应面试验方案及结果

2.2.1 回归方程拟合

Design-Expert 12.0 软件对数据进行回归拟合分析,得到二次回归模型拟合及方差分析见表3。

表3 方差分析表

款冬花总黄酮含量=50.70+1.23A+1.19B+0.7083C+1.34D+1.39AB+0.5090AC+1.18AD-0.7225BC+1.71BD+0.5175CD-5.05A2-3.31B2-5.31C2-5.13D2。

由方差分析可知,乙醇浓度、料液比和提取温度的一次项及二次项对款冬花总黄酮的提取均达到了极度显著水平(P<0.01);料液比和提取温度的交互效应对款冬花黄酮含量的影响达到了极显著水平(P<0.01);提取时间的一次项、乙醇浓度与料液比及乙醇浓度与提取温度的交互作用对总黄酮提取影响达到了显著水平(P<0.05),提取时间与其余因素的两两交互项均为不显著。根据回归方程系数及方差表可知,四个变量中对款冬花总黄酮含量(Y)影响最大的是提取温度(D),其次为乙醇浓度(A),料液比(B),而提取时间(C)对总黄酮含量影响最小。

2.2.2 响应面分析

两两交互效应对款冬花总黄酮提取含量影响的响应面及其等高线如图5～7所示。等高线图表示在同一椭圆曲线上,款冬花总黄酮的含量是相同的。响应面坡度越陡峭,相应的等高线排列越密,说明该坐标轴因素变化对款冬花总黄酮含量影响越大。相反响应曲面坡度越缓,等高线排列越稀,则该因素条件变化对响应值的影响也越小。等高线的形状也可体现因素间交互效应的强弱,形状越趋向椭圆或椭圆轴线与坐标轴间角度越大,表明因素间的交互效应越显著,对提取款冬花总黄酮含量的影响越大。反之等高线形状越接近圆形或椭圆轴线与坐标轴角度越小,则表明因素间的交互效应比较弱,对款冬花总黄酮含量的影响较小。

图5 提取温度和料液比交互作用的响应曲面及等高线

分析图5等高线图,提取温度的等高线比料液比排列紧密,表明提取温度的主效应大于料液比。图5中等高线与图6、图7比较,更趋向椭圆且椭圆轴线与坐标轴角度更大,表明提取温度和料液的交互作用要明显强于图6和图7中两两交互效果。验证了方差显著性检验中,BD交互效果极显著,而AB、AD交互作用显著的结果。

图6 乙醇浓度和料液比交互作用的响应曲面及等高线

图7 提取温度和乙醇浓度交互作用的响应曲面及等高线

2.3 优化提取的验证实验

响应面优化款冬花总黄酮含量的最佳提取工艺为:乙醇体积分数61.81%,提取时间152.06 min,提取温度81.96 ℃,料液比为1∶41.34(g∶mL),款冬花总黄酮含量的预测值51.13 mg/g。考虑实际限制,对最优条件进行调整:乙醇体积分数62%,提取时间152 min,提取温度82 ℃,料液比1∶41(g∶mL),进行款冬花总黄酮提取,重复实验3次,实际款冬花总黄酮含量为50.11 mg/g,为模型理论预测值的98%,与模型预测值高度相符。相对标准偏差为0.54%,说明此方法测得款冬花总黄酮含量的精密度较高。故采用响应面优化得到的款冬花总黄酮提取工艺稳定,数据准确,可用于提取款冬花总黄酮的大规模生产。

3 结论

依据响应面法得到的回归模型探讨得到最佳的工艺条件为: 提取温度82 ℃,乙醇体积分数62%,提取时间152 min,料液比1∶41(g∶mL),款冬花总黄酮含量可达50.11 mg/g,理论含量为51.13 mg/g。回归模型拟合度高。优化了款冬花总黄酮的提取工艺。结果表明,此工艺条件良好可行,能够为款冬花总黄酮在医药、化妆品领域的应用提供理论基础。