猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白特异性纳米抗体的原核表达及鉴定

王 鑫，张洪亮，秦志华，郑乾坤，黄 娟，董绍明，杨瑞梅，曲光刚，单 虎

（1.山东省预防兽医学重点实验室，青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；3.得利斯集团有限公司，山东潍坊 262216）

1987年猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）在美国首次暴发，随后在许多生猪生产国家广泛传播，对全球养猪业造成了巨大经济损失。PRRS症状较为复杂，主要表现为妊娠母猪呼吸困难、体重减轻、生长状态差、繁殖障碍以及各日龄仔猪的呼吸系统症状[1]。我国于1991年在台湾地区发现该病。郭宝清等[2]在1996年首次从国内发病猪群中分离出猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）。PRRSV是一种囊膜正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，同属病毒还包括马动脉炎病毒、小鼠乳酸脱氢酶升高病毒和猴出血热病毒。GP5是PRRSV主要的衣壳糖蛋白，其相对分子质量约为25 kDa，在PRRSV感染和组装过程中发挥着重要作用。该蛋白由1个N-末端信号肽（SP）、2个胞外结构域、2个跨膜结构域（TMS）和1个C-末端细胞质结构域组成，在2个胞外域之间存在1个高变区，与病毒识别靶细胞受体有关[3-5]。GP5是PRRSV最重要的免疫原性蛋白，具有中和表位，且PRRSV感染后康复猪体内中和抗体主要针对GP5[6]。纳米抗体（nanobody）天然缺失轻链，相对分子质量小，仅约15 kDa，是目前最小的功能抗体片段。与传统单克隆抗体相比，纳米抗体拥有更小的体积以及更简单的结构，成本也相对较低，有更广阔的应用前景。纳米抗体具有更高的特异性和结合活性，能耐酸、碱、表面活性剂等化学试剂，易于改造，在微生物、哺乳动物细胞系和植物中的表达水平很高[7]。近几年来，纳米抗体在体外诊断、治疗性抗体药物研发、细胞递送和肿瘤研究等领域均获得了广泛应用[8-10]。

目前，养殖场主要通过合理的疫苗免疫程序来防控PRRS。由于PRRSV极易发生变异，现有弱毒疫苗无法提供完全保护，且弱毒疫苗免疫猪场后存在毒力返强风险。灭活疫苗虽然免疫效果较弱毒疫苗差，但无散毒风险，在我国养猪场得到了广泛使用[11]。本研究利用大肠杆菌原核表达系统对本实验室前期淘洗获得的PRRSV GP5蛋白特异性纳米抗体序列（VHHGP5）进行表达，并对所制备的特异性纳米抗体进行活性鉴定，以期为PRRS检测和治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

克隆宿主菌E.coliTOP10、表达宿主菌E.coliBL21（DE3）、pCold-SUMO-FLAG载体，均由滨州畜牧兽医研究院提供；T4 DNA连接酶、限制性内切酶，购自NEB公司；T4 DNA连接酶、DL 2 000 DNA Marker、核酸染料，购自Takara公司；质粒小量提取试剂盒和胶回收试剂盒，购自Omega Bio-Tek公司；2×TaqPlus Master Mix（Dye Plus），购自南京诺唯赞公司；Unstained Protein MW Marker，购自赛默飞世尔公司；抗FLAG鼠源单抗、HRP标记的羊抗鼠IgG、氨苄青霉素（ampicillin），为SIGMA公司产品；Ni-NTA亲和层析柱，购自常州天地人和生物科技有限公司；异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、BCA蛋白定量试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；ImMobilon-P醋酸纤维素膜（PVDF），购自Merck公司；PRRSV GP5蛋白、传染性法氏囊病毒特异性纳米抗体VHHIBDV，由山东绿都生物科技有限公司制备。其他常规试剂均为国产分析纯。

图1 VHHGP5基因PCR扩增结果

图2 菌液PCR鉴定结果

图3 VHHGP5纳米抗体重组蛋白表达形式鉴定结果

图4 纯化后VHHGP5蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分析结果

图5 Western blot分析结果

1.2 VHHGP5基因片段扩增

根据前期本实验室通过噬菌体展示技术得到的PRRSV GP5特异性纳米抗体基因序列，设计1对特异性扩增引物（F：5'-CGGGATCCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAG-3'；R：5'-CCCAAGCTTATGAGGAGACGGTGACCAGGGTC-3'）。引物含有BamHI 和HindIII酶切位点，用于将纳米抗体基因片段扩增克隆到pCold-SUMO-FLAG载体上，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

以本实验室前期保存的PRRSV GP5特异性纳米抗体基因扩增后的胶回收产物作为模板，利用上述合成的引物对VHHGP5基因进行PCR扩增。PCR反应体系25.0 μL：VHHGP5基因模板1.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，ddH2O 17.5 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 35 s，67 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR反应结束后，将扩增产物在120 V 25 min条件下进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，400 bp大小的电泳条带即目的条带，切除目的条带并进行胶回收。

1.3 纳米抗体重组表达载体构建

使用BamHI和HindIII限制性内切酶，分别对VHHGP5胶回收产物和pCold-SUMO-FLAG重组质粒进行双酶切，回收并纯化酶切产物，以T4 DNA连接酶连接后，将连接产物转化至E.coliTOP10感受态细胞，最后涂布于LB平板，置于37 ℃温箱过夜培养。挑取单菌落进行PCR鉴定，对鉴定为阳性的菌液提取质粒，并送至生工生物工程有限公司进行测序，若测序结果正确即证明重组质粒VHHGP5-pCold-SUMO-FLAG构建成功。

1.4 VHHGP5纳米抗体诱导表达

将重组质粒VHHGP5-pCold-SUMO-FLAG转入E.coliBL21（DE3）感受态细胞，随后涂布于平板，倒置于37 ℃温箱中过夜培养。挑取单菌落于LB液体培养基过夜培养，取50 μL过夜培养的菌液接种至5 mL LB液体培养基中，待培养至OD600nm约为0.6时，加入5 μL IPTG（1 mol/L），在22 ℃160 r/min条件下诱导表达7 h，同时将未添加IPTG的菌液作为阴性对照；诱导表达完成后，10 000 r/min离心1 min收集菌体沉淀，使用500 μL PBS溶液重悬后进行超声破碎，4 ℃10 000 r/min离心10 min，分离上清及沉淀；以SDS-PAGE凝胶电泳分析重组蛋白表达情况，将表达后的纳米抗体重组蛋白命名为VHHGP5。

1.5 VHHGP5纳米抗体纯化

由于构建的重组质粒载体含有6×His标签，因此使用Ni-NTA亲和层析柱对VHHGP5蛋白进行纯化。对VHHGP5进行大量诱导表达：将5 mL重组菌液接种至500 mL LB液体培养基，诱导表达条件同1.4；诱导表达完成后，10 000 r/min离心10 min收集菌体沉淀，重悬后进行超声破碎，对破碎后产物离心并收集上清；参照Ni-NTA亲和层析柱产品说明书步骤，对上清中的VHHGP5蛋白进行纯化，将获得的纯化蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，并按照BCA试剂盒说明书测定纯化后的VHHGP5蛋白浓度。

1.6 VHHGP5纳米抗体ELISA效价分析

以PRRSV GP5蛋白作为抗原（包被质量浓度为10 μg/mL）包被96孔酶标板，4 ℃过夜；使用3%脱脂奶粉进行封闭，洗涤后依次加入6个梯度稀释（1:100、1:1 000、1:10 000、1:50 000、1:100 000和1:200 000）的VHHGP5重组蛋白，同时以未诱导的VHHGP5-pCold-SUMO-FLAG菌液超声后的上清（稀释50倍）作为阴性对照，37 ℃孵育1 h；PBS洗涤后，以抗FLAG鼠源单抗作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗进行孵育；用TMB溶液显色15 min后终止显色，使用酶标仪读取OD450nm值。

1.7 VHHGP5纳米抗体Western blot分析

为验证获得的纳米抗体VHHGP5与PRRSV GP5蛋白能否特异性结合，以Western blot试验对表达的纳米抗体重组蛋白进行鉴定。对GP5蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转移至醋酸纤维素膜，置于封闭液中封闭1 h，加入不同稀释度（1:100、1:1 000、1:2 000）的VHHGP5重组蛋白孵育，同时以本实验室保存的VHHIBDV纳米抗体重组蛋白作为阴性对照；以抗FLAG鼠源单抗作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗进行孵育，使用ECL化学发光显色液避光显色2 min并拍照观察结果。

2 结果

2.1 VHHGP5目的基因扩增

以前期筛选得到的PRRSV GP5蛋白特异性VHH基因的胶回收产物为模板，使用特异性引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。结果（图1）显示，扩增出大小约为400 bp的目的条带，与预期条带大小一致。

2.2 纳米抗体重组表达载体构建

菌液PCR鉴定结果（图2）显示，挑选的单克隆中，有3个菌液成功扩增出大小约400 bp的目的条带。对阳性菌液提取质粒并送测序，发现阳性菌液质粒测序正确，表明重组表达载体VHHGP5-pCold-SUMO-FLAG构建成功。

2.3 VHHGP5纳米抗体表达及纯化

使用IPTG作为诱导剂对目的蛋白进行诱导表达，并通过SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白表达形式。结果（图3）显示，重组载体VHHGP5-pCold-SUMO-FLAG在诱导后表达出一条约36 kDa的蛋白条带，且VHHGP5蛋白为可溶性表达，主要存在于超声后菌体上清中，而沉淀及未诱导的菌液则条带不明显。随后，按照诱导表达条件对VHHGP5纳米抗体重组蛋白进行大量表达并通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，获得了纯化蛋白（图4），经BCA方法测定，纯化后的VHHGP5纳米抗体重组蛋白质量浓度为2 mg/mL。

2.4 VHHGP5纳米抗体活性测定

将纯化后的VHHGP5纳米抗体进行倍比稀释，并与固相包被的GP5蛋白进行间接ELISA试验，以试验孔OD450nm大于阴性对照孔3倍以上作为阳性判定标准。结果（表1）显示，纯化后的VHHGP5纳米抗体重组蛋白ELISA效价为1:50 000，效价较高。

表1 间接ELISA效价检测结果

2.5 Western blot鉴定

VHHGP5纳米抗体重组蛋白Western blot分析结果（图5）显示，该纳米抗体能够与PRRSV GP5蛋白发生特异性反应，表明所制备的纳米抗体可特异性识别GP5蛋白，具有良好的反应性。

3 讨论

PRRS发病率及死亡率高、传播迅速，给我国养猪业带来了较大经济损失。GP5是PRRSV的主要结构蛋白，具有多个中和位点，被认为是获得中和抗体的理想蛋白。市面上已有通过包被GP5蛋白来检测PRRSV的商品化试剂盒。传统的单克隆抗体在诊断中发挥着重要作用，但它们的生产在技术上要求很高，而且昂贵。单克隆抗体的大尺寸（150 kDa）使其进行重组成为一个挑战。纳米抗体仅由两条重链组成，天然缺失轻链，有相对分子质量小、稳定性强、易于制备以及更容易进行基因工程改造等特点[12]。目前纳米抗体已被广泛应用于疾病诊断和治疗中[13-14]。Ma等[15]利用制备的特异性纳米抗体构建了检测猪流行性腹泻病毒的阻断ELISA方法，检测效果与商品化检测试剂盒相当。由此可见，纳米抗体作为新兴分子生物学工具正应用于动物疫病防控中。

本研究利用大肠杆菌原核表达系统，成功制备了针对PRRSV GP5蛋白的特异性纳米抗体。该纳米抗体在大肠杆菌中呈可溶性表达，间接ELISA检测显示其结合效价可达1:50 000。此外，本试验使用的原核表达系统大大降低了蛋白制备成本，纯化蛋白的步骤也较为简便，适合进行大批量生产。在后续研究中，VHHGP5纳米抗体可用于构建ELISA、胶体金等检测方法以及探究PRRSV感染机制。综上，本研究制备了针对PRRSV GP5蛋白的纳米抗体，其可特异性识别GP5蛋白，为PRRS检测用及治疗用新型抗体开发奠定了基础。