高效液相色谱法测定杜仲叶中4种成分含量

黄继红

（湘西土家族苗族自治州食品药品检验所，湖南 吉首 416000）

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）为杜仲科植物，《中华人民共和国药典》2020年版一部记载，杜仲叶（杜仲科植物杜仲的干燥叶），具有补肝肾、强筋骨功能，并确定绿原酸为杜仲叶药材的主要药用有效成分，绿原酸含量不得少于0.08 %[1]。研究表明，杜仲叶中含有木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类等多种化合物[2-5]，杜仲叶或其提取物具有抗氧化、抗炎杀菌、降血压、降血脂、降血糖、免疫调节、抗衰老等作用[4-10]。本文建立了高效液相色谱法（HPLC）同时测定杜仲叶中绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、异槲皮苷4种成分含量的分析方法，通过检测武陵山区3处种植基地杜仲叶中不同采收时间4种活性成分含量数据，为分析不同提取物的最佳采收期提供技术和数据参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱仪（SPD-M20A光电二极管阵列紫外可见光检测器，日本岛津），KQ5200V型超声波清洗器（昆山市超声仪器公司），TG16-II医用离心机（湖南平凡科技），ML304T /02电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）]。

1.2 材料与试剂

桃叶珊瑚苷对照品（纯度≥98 %，批号：MUST-21100811，成都曼思特）、京尼平苷酸对照品（纯度≥98 %，批号：MUST-21062003，成都曼思特）、绿原酸（纯度99.7 %，批号：21081161，坛墨质检-标准物质中心）、异槲皮苷对照品（纯度≥98 %，批号：MUST-21041613，成都曼思特）；甲醇、乙腈、磷酸，色谱纯。

1.3 试验样品

武陵山区3处种植基地的新鲜杜仲叶，于2021年7～11月每月采集一批次，60 ℃低温烘干，粉碎过筛后，阴凉干燥处保存。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 对照品溶液的配制 称取适量桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸，异槲皮苷（精确至0.0001 g），加入70 %甲醇水溶液超声溶解，定容，配制成桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷浓度分别为1.02，1.06，1.05，1.07 mg/ml的混合对照品储备溶液。

2.1.2 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；柱温：30 ℃；检测器波长范围：190～400 nm，检测波长：桃叶珊瑚苷200 nm、京尼平苷酸238 nm、绿原酸326 nm、异槲皮苷354 nm；流动相：0.1 %磷酸水溶液（A）、乙腈（B），流速：1 ml/min；进样量：10 µl。

表1 不同时间段的流动相梯度

2.1.3 检测波长的选择 对照品经HPLC分离和单个对照品以出峰时间定位后，对不同浓度的桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷色谱峰在190～400 nm区间吸收光谱图分析比较，并考虑样品的实际检测情况，对4种成分选取了各自适合的检测波长：桃叶珊瑚苷200 nm、京尼平苷酸238 nm、绿原酸326 nm、异槲皮苷354 nm，对照品4种检测波长比较见图1。

图1 对照品4种检测波长比较图

2.1.4 样品前处理方法 称取制备好的样品约0.5 g置入50 ml离心管，加入25 ml 70 %甲醇水溶液，混匀，50 ℃超声波提取30 min，冷却至室温，5000 r/min离心5 min，取上清适当稀释后过0.45 μm有机微孔滤膜，待测。

2.2 标准曲线

取2.1.1项混合对照品储备溶液适量，用70 %甲醇水溶液稀释成桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸，异槲皮苷质量浓度分别为51，53，52.5，53.5 µg/ml的中间液，再用70 %甲醇水溶液稀释成质量浓度为中间液质量浓度的1.0，0.4，0.2，0.1，0.04，0.02倍的6个不同质量浓度的混合对照品溶液。按2.1.2项条件进样分析，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。结果表明，各成分在各自的质量浓度范围内均有良好的线性关系，且分离效果良好，线性关系结果见表2，混合对照品和杜仲叶样品色谱图（波长：200 nm）见图2。

图2 混合对照品和杜仲叶样品液相色谱图（波长：200nm）

表2 杜仲叶中4种成分标准曲线线性关系

2.3 重复性试验

称取同一批次的杜仲叶样品6份，按2.1.2项和2.1.4项下方法对样品进行前处理和进样分析，根据各成分标准曲线进行定量分析，检测含量结果以干基计，计算各成分含量相对标准偏差（RSD）。结果，桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷平均含量分别为17.09，8.28，38.17，3.49 mg/g，RSD分别为2.08 %，3.60 %，0.48 %和0.68 %，表明方法重复性较好。

2.4 待测溶液稳定性试验

取杜仲叶样品，按2.1.2项和2.1.4项下方法对样品进行前处理和进样分析，每6 h进一次样，持续24 h，记录各成分的峰面积，并计算各成分峰面积RSD，桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷峰面积RSD分别为0.82 %，0.13 %，0.10 %，0.42 %，表明样品待测液在24 h内有良好的稳定性。

2.5 加标回收试验

称取已测桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷4种成分含量分别为3.04，0.93，2.77，0.46 mg/g的同一批次的杜仲叶样品6份，每份约0.5 g，分别加入混合对照品溶液（按2.1.1 项下方法配制的桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸，异槲皮苷质量浓度分别为1.49，0.93，1.30，0.70 mg/ml的混合对照品溶液）0.5 ml和70 %甲醇水溶液24.5 ml，按2.1.2项和2.1.4项下方法对样品进行前处理和进样分析，计算各成分的加标回收率。结果表明，桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷的加标回收率分别为99.96 %，99.40 %，95.03 %，95.46 %，RSD分别为3.33 %，2.13 %，2.82 %，1.31 %。

2.6 样品检测

称取1.3项下杜仲叶样品约0.5 g，按2.1.2项和2.1.4项下方法对样品进行前处理和进样分析，含量结果以干基计，结果见表3。由表3可见，杜仲叶样品中4种成分总体上含量高低依次为绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和异槲皮苷，绿原酸含量相对稳定，含量为19.32～52.55 mg/g。桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸采集时间不同含量差别较大，含量分别为2.87～40.79和1.17～24.98 mg/g。异槲皮苷的含量相对较少，含量为2.55～9.83 mg/g。在不同的采收时期，绿原酸和异槲皮苷含量相对稳定，桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸含量差别较大。绿原酸和异槲皮苷在11月份含量最高，桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸在9月份含量最高。

表3 杜仲叶样品检测结果表（n=3）

3 结论

本文建立了一种同时测定杜仲叶样品中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷4种成分的试验方法，4种成分在各自的质量浓度范围内均有良好的线性关系；此法重复性好、回收率高、样品前处理操作简单，适合多批次样品连续进样。对武陵山区种植杜仲基地采收样品检测结果表明，杜仲叶样品中4种成分总体上含量高低依次为绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和异槲皮苷，桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸在9月份含量最高，绿原酸和异槲皮苷在11月份含量最高。