高效液相色谱法测定甜梦胶囊中4种成分

李志娇，巩长芹，张晓博，陈 静，方君卉，杨小薛

（1. 临沂市检验检测中心，山东 临沂 276001；2. 齐鲁制药有限公司，山东 济南 250000；3. 东阿阿胶健康连锁有限公司，山东 临沂 276001；4. 枣庄市食品药品检验检测中心，山东 枣庄 277102）

甜梦胶囊，是在奇效年良方《枸杞丸》基础上加味组方而成，主要成分有刺五加、淫羊藿、黄芪、陈皮、黄精、党参、枸杞子、黄花、山楂等，具益气补肾，健脾和胃，养心安神之功效，可改善心脾两虚患者失眠、多梦症状，缓解焦虑、抑郁情绪；临床上多用于头晕耳鸣，视减听衰，失眠健忘，食欲不振，腰膝酸软，心慌气短，卒中后遗症等症[1-2]。通过检索文献[2-4]，发现关于甜梦胶囊的特征性成分含量测定的报道较少，不能很好地监测药品的质量。本实验采用高效液相色谱-波长切换法测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、朝藿定C以及橙皮苷4种特征性成分的含量，能更好地控制药品的质量。

1 材料与仪器

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent 1260 Q u a t 泵，D A D 检测器，四元在线脱气机）；Thermo Hypersil Gold AQ（赛默飞世尔科技中国公司）色谱柱；XS205型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为十万分之一）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）；Milli-Q超纯水机（法国默克）。

1.2 药品与试剂

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号：111920-201907，含量以96.8 %计）、淫羊藿苷对照品（批号：110737-202017，含量以98.1 %计）、朝藿定C对照品（批号：111780-201905，含量以94.3 %计）、橙皮苷对照品（批号：110721-202019，含量以95.3 %计）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯（默克公司）；甲酸为色谱纯（阿拉丁）；水为超纯水；甜梦胶囊[荣昌制药（淄博）]，批号：210107，210402，220207，211202）。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil Gold AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2 %甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，A 15 %→30 %；20～30 min，A 30 %→35 %；30～40 min，A 35 %→40 %）；流速为1.0 ml/min；检测波长：260 nm（0～12 min，检测毛蕊异黄酮苷）、283 nm（12～18 min，检测橙皮苷）、270 nm（18～40 min，检测淫羊藿苷、朝藿定C）；柱温为30 ℃；进样量为5 μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品11.33 mg、淫羊藿苷对照品11.19 mg、朝藿定C对照品13.73 mg，橙皮苷对照品10.75 mg，分别置入50 ml棕色量瓶，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液，备用。分别精密吸取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照储备液、淫羊藿苷对照储备液、朝藿定C对照储备液、橙皮苷对照储备液6.0，15.0，1.0，5.0 ml，置入同一50 ml棕色量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取甜梦胶囊内容物，混匀，研细，取5 g，精密称定，置入具塞锥形瓶，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声提取30 min（功率300 W，频率40 kHz），放冷，用甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性溶液制备 按甜梦胶囊的处方工艺，分别制备缺少黄芪、陈皮、淫羊藿的阴性样品，按供试品制备方法，制备成阴性溶液。

2.3 专属性试验

取对照品溶液、供试品溶液和阴性溶液，按2.1项色谱条件进样分析。结果在供试品溶液色谱图中，呈现与混合对照品保留时间一致的特征峰，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷的保留时间分别为10.08，13.64，23.44，24.26 min，阴性溶液未呈现与照品保留时间一致的特征峰，表明阴性样品对所测组分没有干扰，各被测成分理论塔板数均大于15 000，各成分间的分离度均大于3.0，见图1。

图1 甜梦胶囊中4种成分HPLC图

2.4 线性关系

取2.2项下对照品溶液1，2，5，8，10，12，15 μl，按2.1项下色谱条件进样分析，记录液相色谱图。以峰面积为纵坐标Y，进样量为横坐标X（μg），计算回归方程。结果见表1。

表1 回归方程及其范围

2.5 精密度

取2.2项下对照品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，记录4种成分的峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷峰面积平均值分别为101.5，1067，321.9，306.6，RSD分别为0.32 %，0.27 %，0.67 %，0.24 %，表明仪器精密度较好。

2.6 重复性

分别精密称取同一批次（批号：220207）样品6份，按2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷峰面积平均值分别为97.88，1054，316.8，303.4，RSD为0.51 %，0.46 %，0.78 %，0.60 %，表明方法重复性良好。

2.7 溶液稳定性

取同一样品（批号：220207）溶液，放置室温中，分别在配制后0，4，6，8，10，12，24，36 h，进样分析，进样量为5 μl，记录峰面积。结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷面积的平均值分别为99.36，1065，321.5，310.2，RSD分别为1.02 %，0.73 %，1.04 %，1.56 %，表明供试品溶液36 h内比较稳定。

2.8 加样回收

取已知含量的同一批次（批号：220207）样品6份，每份约0.1 g，精密称定，置入具塞锥形瓶，每份分别精密加入毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷对照品储备溶液1.0，5.0，5.0，6.0 ml，按2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进样测定，进样量为5 μl，计算回收率。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均回收率为98.86 %、橙皮苷平均回收率为98.29 %、朝藿定C平均回收率为98.87 %、淫羊藿苷平均回收率为99.12 %，RSD均在2.0 %以内。

2.9 样品测定

取4批甜梦胶囊（批号：210107，210402，220207，211202），按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，进样量为5 μl，记录峰面积，按外标法计算，结果见表2。

表2 甜梦胶囊中4种成分含量测定结果/mg·g-1（n=2）

3 讨论

3.1 波长的选择

对毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷在190～400 nm进行全波长扫描，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在260 nm、橙皮苷在283 nm、朝藿定C、淫羊藿苷在270 nm处有最大吸收，因此选择260 nm作为毛蕊异黄酮葡萄糖苷的测定波长、选择283 nm作为橙皮苷的测定波长、选择270 nm作为朝藿定C、淫羊藿苷测定波长。

3.2 流动相的选择

参考《中国药典》2020年版一部中黄芪、淫羊藿及陈皮[5]和相关文献[6-10]，以乙腈-0.1 %磷酸溶液、乙腈-0.1 %甲酸溶液、乙腈-0.2 %甲酸溶液、乙腈-水梯度洗脱，乙腈-水等度洗脱。通过试验，结果以乙腈-0.2 %甲酸溶液为流动相梯度洗脱，峰形好，4种成分分离度高，阴性样品干扰小。

3.3 提取溶剂方法的选择

参考文献[2-10]，试验中考察了甲醇、50 %甲醇、70 %甲醇、稀乙醇作为提取溶剂，以及加入不同体积（20，25，50 ml）的提取溶剂。结果用25 ml甲醇作为提取溶剂，提取率最高；考察了超声20，30，45，60 min，及回流45，60 min的提取效果，结果表明，加入25 ml甲醇超声处理30，60 min与回流60 min，测得的结果相差很小，因此选择操作简单的超声方法作为该试验的提取方法，省时、简便。