黄岛口岸送检蜚蠊的分子鉴定
2023-11-07钱云开滕新栋通信作者
刘 迪，张 祎，钱云开，滕新栋（通信作者）
（1.青岛海关，山东 青岛 266071；2.秦皇岛海关，河北 秦皇岛 066000）
蜚蠊，俗称蟑螂（cockroach），隶属于蜚蠊目（Blattaria）蜚蠊科（Blattidae），是与人类生活密切相关的室内卫生害虫，也是国境口岸常见的病媒生物，全世界已知有5 000 多种［1］。蜚蠊是一种古老的昆虫，生命周期长、发育速度快、产卵多［2］。除交配产卵繁殖外，雌性蜚蠊还可通过孤雌生殖维持种群，繁殖能力极强。此外，蜚蠊还具有极强的环境适应能力，无水无食时可存活12～90 d。成虫及其卵鞘可通过火车、飞机、轮船等各类交通工具传播至世界各地并定居繁衍，例如已经定居中国的美洲大蠊、德国小蠊。蜚蠊的这些生物学特性使其易于在环境中大量繁殖并生存，而全球经济、人口、货物的快速流动及气候变化进一步为蜚蠊入侵及定殖提供了便利条件。
传统的蜚蠊分类鉴定以形态学鉴定技术为依据，但诱蟑盒或粘蟑板捕获的蜚蠊经常存在残缺不全、辨认难度高等问题［3］。DNA 条形码技术自研发以来，因其准确度高、不受样品形态影响等多种优点，已成为识别和发现物种的强大分类学工具［4-6］。线粒体细胞色素C 氧化酶亚基I（COI）基因是DNA条形码技术常用的靶点，目前也已有许多针对蜚蠊COI 基因的分类研究［3，7-8］。本研究通过形态学鉴定及DNA 条形码鉴定相结合的方法对黄岛海关蜚蠊监测过程中捕获的7 只蜚蠊进行鉴定。
1 材料与方法
1.1 标本来源
本研究使用的样品来自2023 年黄岛海关蜚蠊本底监测过程中利用诱蟑盒捕获的蜚蠊，共计7 只。
1.2 形态学鉴定
根据《我国蜚蠊目昆虫室内常见种类、分布及主要种的检索表》［9］及SN/T 4280.4—2016《国境口岸美洲大蠊形态及DNA 条形码鉴定方法》，利用体视显微镜对送检的蜚蠊进行形态学鉴定。
1.3 DNA 条形码鉴定
取每只蜚蠊的一小段后足，按照核酸提取试剂盒（Takara 公司）说明书的要求进行线粒体基因组DNA 提取。PCR 引物及扩增条件参照文献进行［10］，扩增产物由上海生工青岛有限公司测序。测序结果通过DNAman 软件分析处理后上传至NCBI 进行序列比对。
1.4 NJ 进化树构建与分析
将此7 只蜚蠊的COI 基因序列、美洲大蠊标准序列以及相似种蜚蠊序列导入Mega11 软件，分析处理后采用邻接法构建NJ 系统发育树（neighborjoining tree）。
2 结果
形态学鉴定结合分子鉴定结果显示，本次捕获的7 只蜚蠊均为美洲大蠊。
2.1 形态学鉴定
体视显微镜下观察，美洲大蠊体型大，前胸背板横椭圆形，中部有一标志性蝶形大斑，赤褐色至黑褐色，后缘褐色，由中央向后延伸呈须状，前缘有淡黄色“T”形小斑。前翅褐色无花纹，长度超过腹部末端。尾须较长而末端很细小。肛上板长大，中央有一深凹口。雄虫肛上板半圆形无色透明，雌虫肛上板略呈三角形赤褐色不透明。尾刺圆柱形。
2.2 DNA 条形码鉴定
PCR 扩增产物测序后得到全长658 bp 的序列。测序所得序列在GenBank 中比对结果显示，7 只蜚蠊样本序列与GenBank 中的美洲大蠊（登录号：MT011509.1、MH184241.1、KU543637.1）COI 基因相似性为98.91%～100.00%。（见表1）。
表1 蜚蠊样本COI 基因相似性比对结果
2.3 NJ 进化树构建与分析
下载美洲大蠊登录号为 MH184241.1、KU543637.1、MT011509.1 的标准序列，选取褐斑大蠊（Periplaneta brunnea，NC_039940.1），澳洲大蠊（Periplaneta australasiae，KX640825.1）、黑 胸 大 蠊（Periplaneta fuliginosa，NC_006076.1）为 相 关 近 似种，从NCBI 数据库中下载相应物种的DNA 条形码序列，使用Mega 11 软件构建系统发育树，进一步确认分子鉴定的结果。结果显示样品蜚蠊与美洲大蠊序列形成一个单系，与近似种蜚蠊显著区分开。样品蜚蠊与GenBank 中美洲大蠊（MH184241.1、KU543637.1、MT011509.1）的遗传距离均＜0.02，且置信度为100，证明本次捕获的蜚蠊均为美洲大蠊（见图1）。
图1 基于COI 基因序列构建的系统发育树
3 讨论
形态学鉴定技术仍是目前普遍使用的鉴定技术，短时间内难以被其他方法完全取代。但已有许多研究表明，DNA 条形码鉴定技术可以弥补形态学鉴定技术的不足，二者结合可以有效提高物种鉴定的效率及准确性［11-12］。本研究通过形态学鉴定结合DNA 条形码鉴定的方法，明确了黄岛口岸送检的7只蜚蠊均为美洲大蠊。
美洲大蠊为蜚蠊科大蠊属的昆虫，原产于非洲北部，公元16 世纪前后随人类活动进入美洲，随后传播至世界各地［13］。美洲大蠊是山东省常见蜚蠊物种［14-15］，在2006—2019 年间多次全国蜚蠊监测中，美洲大蠊的数量也仅低于德国小蠊［16-18］，此次捕获的7 只蜚蠊均为美洲大蠊也可证明该蜚蠊物种在黄岛口岸占比较高。美洲大蠊可通过体表机械性及体内生物性携带、传播多种病原微生物，已分离出痢疾杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌等40 种细菌，包括一些重要的耐药菌，以及乙肝表面抗原、脊髓灰质炎病毒、腺病毒等多种病毒［19-20］。此外，美洲大蠊还携带多种过敏原，被其污染的食物或者被咬都可能引发过敏反应，如皮炎、呼吸道过敏等［21］。
美洲大蠊繁殖快、对环境适应性强、危害程度大，易于随国际航行船舶远距离扩散，从口岸入境后可迅速在适宜的生态环境中定殖甚至造成传染病的流行。积极进行输入性病媒生物监测及其携带传染病的防控对于预防上述现象的发生尤为重要。因此，国境口岸需进一步提高对病媒生物监测的重视，加大监测力度、密度和范围，防范口岸病媒生物及其传播传染病的输入。
