快速去除实验室核酸污染方法的探讨

梁 爽，连贺强，胡海洋，史晓娟，马建敏

（新乡市疾病预防控制中心，河南 新乡 453000）

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术因其良好的灵敏度和特异性［1］，被广泛应用于传染病检测领域，成为在新型冠状病毒（SARSCoV-2，以下简称新冠病毒）感染疫情期间重要的防控检测手段［2］。该技术缺点是操作中易受到核酸污染而导致假阳性结果［3］，所以在区域核酸检测［4］期间，因样本量大、操作不当等原因引起的实验室核酸污染时有发生［5-6］，实验室只能停用。核酸污染的快速去除对于实验室承担紧急检测任务至关重要，但目前可供参考的方法资料十分有限，且在我们的前期实践工作中发现，彻底去除需要5～7 d（数据未发表）。现结合2022 年10 月本实验室核酸污染的消毒处置过程，探讨一种快速有效的去污染方法。

1 材料

1.1 主要使用仪器

全自动核酸提取仪（Zybio EXM3000），荧光定量PCR 仪（杭州博日9600 FQD-96A），高速离心机（Eppendorf 5425），过氧化氢空气消毒机（浙江泰林FHP3）。

1.2 主要使用试剂

磁珠法核酸提取试剂（西安天隆科技有限公司），新冠病毒荧光定量PCR 试剂盒（圣湘生物科技股份有限公司），核酸去除剂（LEMINSCARE），84 消毒液（北京雅特），7.5% 过氧化氢消毒液（泰林生物）。

2 方法

2.1 污染发现与排查

2022 年10 月份区域核酸检测过程中，检出的新冠病毒阳性数量突然增加，多为单靶标（ORFa/b 或N基因）弱阳性，Ct 值在37～40，但同批次检测的空白对照、阴性对照、内质控等结果仍正常。可疑样本使用双试剂（新启封）和备用实验室重新检测，两种试剂结果一致，全部为阴性。疑似该实验室核酸污染。

2.2 消毒前采样

立即开展消毒前的环境采样。对实验室不同区域、各物体表面涂抹采样，共采集25 份样品，送至备用实验室检测新冠病毒核酸，目的是查找污染部位。

2.3 污染的消毒处置

采样后立即使用过氧化氢消毒机对实验室进行7.5% 过氧化氢雾化消毒。分别对试剂配制区、核酸提取区和PCR 扩增区消毒，将房间内生物安全柜前挡、离心机盖子、核酸提取舱门及PCR 仪盖子打开，每个房间（空间40～50 m3）消毒时间设置1 h，结束后密闭房间2 h，进行消毒后第一次采样（方法、数量同上），然后打开机械通风12 h。

之后，依据消毒前采样和消毒后第一次采样检测结果，使用不同浓度的含氯消毒剂对污染部位进行重点消毒。用浓度5 500 mg/L 的84 消毒液对核酸提取仪、冰箱内部及把手等擦拭2 遍，10 min 后，再用清水擦拭3 遍去除余氯。生物安全柜和核酸提取仪仓体内部因构造问题难以擦拭彻底，故再使用自带紫外线灯照射2 h。较难去除污染的是PCR 仪上样孔，本研究使用咽拭子蘸取5 500 mg/L 的84 消毒液逐孔反复擦拭2 遍，再蘸取清水擦拭5 遍以上，最后用核酸去除剂再次喷洒、擦拭，移至通风处。其他未检出阳性的仪器、耗材和地面等用2 000 mg/L的84 消毒液擦拭或拖拭。消毒后再次采样，并打开机械通风12 h。全程时间不超过36 h。

2.4 消毒效果验证

消毒全部结束后，进行消毒后第二次采样检测（方法、数量同上）；同时使用自制的2 套相同的新冠病毒盲样质控品（每套5 份）在该实验室和备用实验室，使用相同试剂分别进行检测。环境样品检测阴性，2 个实验室的盲样检测结果一致，表明污染去除，消毒有效。

3 结果

3.1 消毒前采样结果

消毒前采集的25 份样品，包括操作台面、门把手、仪器、生物安全柜、移液器、地面、墙面等各部位，其中6 份单靶标（N 基因）或双靶标（ORF1ab 和N 基因）阳性，分别是核酸提取仪、PCR 仪和冰箱等。（见表1）。

表1 消毒前后环境样品检测结果

3.2 消毒后采样结果

使用过氧化氢消毒后第一次采样结果显示，核酸提取仓和PCR 仪模块仍检出阳性（见表1）；消毒结束后第二次采样结果，25 份环境样本全部阴性（见表1）；5 份新冠病毒盲样在两个实验室检测Ct值基本一致，且结果正确，空白对照、阴性对照均为阴性，阳性对照出现明显的扩增曲线（见表2）。表明实验室可以使用。

表2 5 份新冠病毒盲样检测室间比对结果

4 讨论

核酸污染难以去除，这是困扰绝大多数实验室的一个难题。本实验室在指导和处理基层实验室去污染过程中，工作思路上倾向于先找明污染来源，然后使用过氧化氢和84 消毒液中的一种，或者两者联合使用，反复消毒、检测，虽然污染最终消除，但所用时间长，严重影响工作。为此，本次在前期数据（未发表）的基础上对采取措施的时间、流程和消毒方法上进行了整体优化，缺憾是因受限于时间以及现实条件，未能设置平行比对实验。但该实验室污染后能够在36 h 重新启用，表明整个流程及方法行之有效。

首先要快速发现污染，本次实验室出现同一反应板阳性数量突然增多，复查后呈阴性，即果断停用实验室，立即按照核酸污染进行消毒。消毒前采样是为了查找污染原因，但完全依赖该结果再采取措施会耽误时间，因引起实验室污染的原因很多，涉及实验活动的方方面面，准确找到原因不是件容易的事［7］。可视为实验室存在气溶胶污染，从而采用过氧化氢雾化消毒。过氧化氢溶液是一种强氧化剂，可游离释放出羟自由基和氧自由基，能分解核酸片段［8］，且雾化形成的气溶胶微粒扩散性好，消毒时不留死角［9］。对一些污染难以消除的重点部位如核酸提取仓、PCR 仪加样模块等，再选择84 消毒液、核酸去除剂及紫外线消毒灯等化学消毒和物理消毒联合去污染。

上述消毒方法适用于核酸污染的应急快速处置，其缺点是高浓度含氯消毒剂和过氧化氢消毒液均具有强氧化性，用于核酸提取仪、生物安全柜及PCR 扩增仪的消毒处理后，应迅速彻底去除消毒剂残留，避免对金属仪器的腐蚀［10］；且在消毒过程中，消毒人员需做好二级防护，防止消毒剂对呼吸系统和皮肤黏膜的刺激。此外，污染去除后，应及时更换实验室排风滤网，避免再次污染。

因此，实验室一定高度重视并严防核酸污染的发生。建议规范各项管理：一是科学制定核酸检测实验室SOP，并严格执行操作规范；二是要强化培训，人员需持证上岗，并落实岗位监督机制；三是加强对易产生气溶胶的仪器的日常消毒，如全自动核酸提取仪在提取核酸过程中，因震荡会造成质控品或阳性样本等核酸挥发形成气溶胶［11］，日常消毒时可以用1 000 mg/L 的含氯消毒剂进行擦拭消毒后开启自身紫外线灯消毒3 h［12］。