REGγ通过Wnt/β-catenin信号通路影响胃癌细胞增殖、迁移和侵袭

罗刚 谢敏慧 杨娟 危群华

(1萍乡市第二人民医院消化科,江西 萍乡 337000;2萍乡市芦溪县第二人民医院内二科;3萍乡市第二人民医院检验科)

胃癌是一种发生在胃部黏膜的常见的恶性肿瘤,是仅次于肺癌的全球第二大癌症死亡原因,严重危害人类健康〔1〕。全球每年胃癌新发病例约100万人,其中男性发病率约是女性的2倍〔2〕。近年来,随着饮食习惯的改善和医疗水平的提高,胃癌发病率和死亡率有所下降,但其平均5年存活率仍在10%以下〔3〕。由于胃癌发生机制十分复杂,临床手术和放化疗等传统疗法对胃癌的治疗具有局限性,尤其是对于早期预测和晚期预后等方面〔4〕。分子靶向治疗的出现为治愈胃癌提供了新的可能性,找到用于早期诊断和治疗的靶点尤为重要。蛋白酶体激活因子(REG)γ(也称之为PA28γ、PSME3和 Ki抗原)是11S蛋白酶体调节颗粒的家族成员,可以通过非腺苷三磷酸(ATP)依赖和非泛素化依赖的方式促进多种蛋白质的降解〔5〕。研究发现,REGγ在多种恶性肿瘤中过度表达,包括乳腺癌、甲状腺癌、肺癌和肝癌,表明REGγ在恶性肿瘤的发生和发展中具有重要作用〔6～8〕。在皮肤癌、黑色素瘤和肺癌等癌症类型中,REGγ被证明是通过Wnt/β-catenin信号通路影响癌症发生〔5〕。Wnt/β-catenin是高度保守的信号通路,参与调控和介导胃癌的增殖、侵袭和迁移等多个过程〔9〕。本研究探讨胃癌细胞中REGγ通过Wnt/β-catenin信号通路对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人胃癌细胞系MGC-803,人正常胃黏膜细胞系GES-1,Wnt/β-catenin 信号通路抑制剂XAV939(美国Selleckchem公司),REGγ siRNA及阴性对照siRNA、Lipofectamine3000试剂、兔抗人REGγ单克隆抗体、兔抗人N-钙黏蛋白(cadherin)单克隆抗体、兔抗人E-cadherin单克隆抗体、兔抗人Snail单克隆抗体、兔抗人β-catenin单克隆抗体、兔抗人C-myc单克隆抗体、兔抗人细胞周期蛋白(Cyclin)D1单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体(美国Invitrogen公司)。DMEM培养基、CCK8试剂(美国Sigma公司),实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒、Transwell小室(美国TaKaRa公司)。

1.2Western印迹检测MGC-803细胞和GES-1细胞中REGγ蛋白水平 取对数生长期的MGC-803细胞和GES-1细胞,加入RIPA裂解液冰上裂解细胞40 min,21 000 r/min离心15 min,提取细胞蛋白,用二喹啉甲酸(BCA)法定量测定蛋白浓度。分别取10 μg蛋白上样,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,再湿法转膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室温下,用5%的脱脂牛奶对膜进行封闭2 h后,加入REGγ单克隆抗体(1∶3 000)4 ℃孵育过夜。一抗孵育完成后,用TBST清洗膜3次,5 min/次,加入二抗(1∶3 000),室温孵育1 h,再次用TBST清洗3次,5 min/次。经显影、曝光和扫描图像后,得到最终的Western印迹结果。

1.3qRT-PCR检测MGC-803 细胞和GES-1细胞中REGγ mRNA水平 取对数生长期的MGC-803细胞和GES-1细胞,加入Trizol试剂,提取细胞总RNA。将RNA逆转录合成cDNA,qRT-PCR法测定MGC-803细胞和GES-1细胞中REGγ mRNA水平。REGγ引物序列正向：5′-TCCTCACCAATAGCCACG-3′;反向：5′-CTCGATCAGCAGCCGAAT-3′〔10〕。PCR条件：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,总计40个循环。以β-actin为内参实时比较PCR扩增程度。

1.4细胞分组和转染 取对数生长期的MGC-803细胞分为空白对照(BC)组、阴性对照(NC)组、XAV939组、siR-REGγ组和siR-REGγ+XAV939 组,接种于6孔板,待细胞密度达到80%时,按Lipofectamine3000试剂盒说明书进行转染。BC组不做任何处理,NC组转染阴性对照siRNA,siR-REGγ组转染REGγ siRNA,XAV939组不转染,只加入抑制剂XAV939(5 μmol/L),siR-REGγ+XAV939 组转染REGγ siRNA并加入XAV939。转染后8 h换液培养,48 h后用Western印迹和qRT-PCR测定细胞REGγ蛋白和mRNA表达。

1.5CCK8测定细胞增殖能力 转染48 h后,取同等数量各组细胞接种于96孔板(4×103个/孔)中,分别于培养0、24、48、72 h后,每孔加入20 μl CCK8,培养2 h后用酶标仪于450 nm波长下测定每组吸光度值,绘制细胞增殖曲线。

1.6Transwell实验测定细胞迁移和侵袭能力 转染48 h后,用无血清DMEM重悬细胞,分别取同等数量各组细胞(2×104个/孔)接种于Transwell小室上室,下室加入15% DMEM培养基,置于细胞培养箱中培养。24 h后将小室取出,用多聚甲醛固定30 min,后用0.2%结晶紫溶液染色30 min,200倍显微镜下拍照计算迁移细胞数。侵袭实验需在实验前以1∶5比例混合无血清DMEM与基质胶包被Transwell小室上室,其余步骤均与迁移实验相同。

1.7Western印迹检测细胞N-cadherin、E-cadherin、Snail、β-catenin、C-myc、CyclinD1蛋白表达 转染48 h后,分别提取各组细胞的总蛋白,测定N-cadherin、E-cadherin、Snail、β-catenin、C-myc、CyclinD1蛋白表达。方法同1.2。

1.8统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1胃癌细胞MGC-803中REGγ表达 胃癌细胞MGC-803中mRNA和蛋白表达(0.51±0.03、0.70±0.01)均显著高于正常胃黏膜细胞GES-1(0.29±0.02、0.57±0.01;t=10.425、14.740,均P<0.01),证明胃癌细胞中REGγ的表达显著上调。见图1。

图1 Western印迹测定GES-1细胞和MGC-803细胞中REGγ蛋白表达

2.2REGγ基因沉默能够有效抑制胃癌细胞MGC-803增殖 24 h时,各组细胞增殖能力差异无统计学意义(P>0.05)。48～72 h时,与BC和NC组相比,siR-REGγ组和XAV939组细胞增殖能力明显降低(P<0.01)。与siR-REGγ组相比,siR-REGγ+XAV939组细胞增殖能力明显降低(P<0.01)。BC组和NC组细胞增殖能力差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组MGC-803细胞中REGγ mRNA和蛋白表达及细胞增殖、迁移、侵袭能力比较

2.3REGγ基因沉默能够有效抑制胃癌细胞MGC-803迁移和侵袭 与BC和NC组相比,siR-REGγ组和XAV939组细胞迁移和侵袭数目显著降低(P<0.01)。与siR-REGγ组相比,siR-REGγ+XAV939组细胞迁移侵袭数明显减少(P<0.01)。BC组和NC组细胞迁移和侵袭数目差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图2。

图2 各组MGC-803细胞迁移和侵袭能力(结晶紫染色,×200)

2.4REGγ siRNA能够有效沉默胃癌细胞MGC-803中REGγ的表达 与BC和NC组相比,siR-REGγ组和XAV939组细胞表达REGγ mRNA和蛋白水平均显著降低(P<0.01)。与siR-REGγ组相比,siR-REGγ+XAV939组细胞REGγ mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。BC组和NC组细胞REGγ mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图3。

1～5：BC组、NC组、XAV939组、siR-REGγ组、siR-REGγ+XAV939组图3 Western印迹测定各组MGC-803细胞中REGγ、N-cadherin、E-cadherin、Snail、β-catenin、C-myc和CyclinD1蛋白表达

2.5各组细胞上皮间质转化情况比较 与BC和NC组相比,siR-REGγ组和XAV939组细胞N-cadherin和Snail蛋白表达显著降低,E-cadherin表达显著增加(P<0.01)。与siR-REGγ组相比,siR-REGγ+XAV939组细胞N-cadherin和Snail蛋白表达显著降低,E-cadherin表达显著增加(P<0.01)。BC组和NC组细胞蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表2。

表2 各组MGC-803细胞中N-cadherin、E-cadherin、Snail、β-catenin、C-myc和CyclinD1蛋白表达

2.6REGγ 基因沉默影响胃癌细胞MGC-803增殖、迁移和侵袭的机制 与BC组和NC组相比,siR-REGγ组和XAV939组细胞β-catenin、C-myc和CyclinD1蛋白表达均显著降低(P<0.01)。与siR-REGγ组相比,siR-REGγ+XAV939组细胞β-catenin、C-myc和CyclinD1蛋白表达明显降低(P<0.01)。BC组和NC组细胞蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表2。

3 讨 论

REGγ最早在系统性红斑狼疮患者的血清中发现〔11〕,可以刺激 20S 核心蛋白酶体的蛋白水解活性〔12〕。REGγ能够促进多个调控细胞周期的关键因子的降解,包括细胞周期素依赖性激酶抑制因子p21〔13,14〕和抑癌基因p53〔15,16〕。通常情况下,蛋白酶体的活性在癌细胞中会增强,以加速癌症的发生和转移〔17〕。REGγ也被证明REGγ在乳腺癌、甲状腺癌、肺癌和肝癌等多种癌细胞中过度表达〔5～7〕,但在胃癌中REGγ的表达和作用尚未明确。本研究提示,人胃癌MGC-803细胞中REGγ的mRNA和蛋白水平显著高于人正常胃黏膜细胞,且沉默REGγ可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,表明REGγ在胃癌的发生和发展具有潜在作用。

上皮质间转化是指上皮到间质细胞的转化,与癌症的发生发展密切相关,从癌细胞起始、生长、侵袭、迁移到定植及对治疗的抵抗过程中,上皮质间转化都起着关键作用〔18〕。N-cadherin、E-cadherin是上皮质间转化的标志蛋白,上皮质间转化过程中通常伴随着N-cadherin表达水平的上升和E-cadherin表达水平的下降〔19〕;而Snail蛋白作为上皮质间转化的重要调控因子,可以抑制E-cadherin的转录与表达〔20〕,进而调控转化过程。在本研究结果表明,沉默REGγ可通过抑制上皮间质转化来抑制胃癌细胞MGC-803的迁移和侵袭。

Wnt/β-catenin信号通路是上皮质间转化的关键性通路,其在癌细胞中通常上调,增加β-catenin的表达;β-catenin上调进一步激活多基因表达,包括C-myc和CyclinD1,两者均为影响细胞周期的关键蛋白,其中C-myc调控细胞周期S期,而CyclinD1调控细胞周期G1期〔21〕。本研究结果表明,REGγ 基因沉默可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响胃癌细胞MGC-803的增殖、迁移和侵袭。