circZNF652靶向调控miR-17-5p对糖氧剥夺诱导的人脑血管内皮细胞损伤的影响

王秋莲 吴著明 叶鹏飞

(大冶市人民医院神经内科,湖北 大冶 435100)

缺血性脑卒中是常发生于中老年人群中的一种脑血管疾病,目前临床常采用溶栓治疗等方法,而血管再通是最有效的方法,但血液供应后氧自由基可造成细胞再灌注损伤,进而造成脑组织损伤,同时缺氧条件下脑血管内皮细胞损伤可进一步损害神经功能,因而如何减轻脑血管内皮细胞损伤对改善缺血性脑卒中等脑血管疾病患者的预后具有重要意义〔1～3〕。环状RNA(circRNA)在脑血管疾病中表达异常,并可参与脑血管内皮细胞损伤过程〔4〕。但circRNA在糖氧剥夺(OGD)诱导的人脑血管内皮细胞损伤中的作用机制尚未阐明。circZNF652在脂多糖诱导的肺炎中表达水平升高,抑制其表达可通过调节miR-181a减轻脂多糖诱导的炎症损伤〔5〕。生物信息学分析显示circZNF652与miR-17-5p存在结合位点,研究发现,miR-17-5p在缺氧/复氧诱导的人脑微血管内皮细胞中的表达明显下调,miR-17-5p过表达可通过靶向磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)而减轻细胞氧化损伤〔6〕。但circZNF652是否通过靶向调控miR-17-5p影响人脑血管内皮细胞(HBVEC)损伤尚不十分清楚。因此,本研究采用OGD诱导的HBVEC建立细胞损伤模型,探讨circZNF652/miR-17-5p分子轴对细胞增殖、凋亡及氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 HBVEC购自美国ATCC;Lipofectamine2000购自美国Thermo Fisher;乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;CCK-8试剂、凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)系列试剂盒购自北京天根生化;si-circZNF652、miR-17-5p mimics、anti-miR-17-5p及其阴性对照物购自广州锐博生物;兔抗人蛋白水解酶(CHOP)单克隆抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-12多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自英国Abcam。

1.2实验分组 HBVEC培养在DMEM完全培养液中,于37 ℃培养箱内进行培养,每2～3 d传代1次。取对数生长期HBVEC接种于6孔板(1×104个/孔),24 h后弃旧培养基,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,更换为无糖DMEM培养基,于95%N2、5%CO2的培养箱内培养6 h,构建细胞OGD损伤模型〔7〕,记为OGD组。在制备OGD损伤模型时同步更换为无血清的培养基处理HBVEC,于37 ℃、5%CO2的培养箱内培养,记为Con组。无血清培养基分别稀释si-NC、si-circZNF652、miR-NC、miR-17-5p mimics、si-circZNF652与anti-miR-NC(共转染)、si-circZNF652与anti-miR-17-5p(共转染)后室温孵育5 min,同时用无血清培养基稀释Lipofectamine2000,分别将脂质体稀释液与基因稀释液共同加入HBVEC培养24 h后进行OGD处理,分别记为OGD+si-NC组、OGD+si-circZNF652组、OGD+miR-NC组、OGD+miR-17-5p组、OGD+si-circZNF652+anti-miR-NC组、OGD+si-circZNF652+anti-miR-17-5p组。

1.3qRT-PCR检测细胞中circZNF652与miR-17-5p表达水平 用RNA提取试剂盒提取HBVEC总RNA,按照试剂盒说明书加入细胞裂解液裂解细胞后提取RNA,检测RNA浓度后将RNA反转录为cDNA,然后通过PCR仪检测目的基因表达情况,2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.4检测氧化应激指标LDH、SOD、MDA水平 采集细胞上清液,根据LDH试剂盒说明书检测LDH水平。取各组HBVEC,弃培养基,PBS洗涤,用细胞裂解液裂解细胞,检测细胞MDA水平与SOD活性,操作步骤按照试剂盒说明书。

1.5CCK-8实验检测细胞增殖 各组HBVEC以2×103个/孔接种于96孔板,培养24 h后,每孔分别加入10 μl CCK-8溶液于37 ℃条件下孵育2 h,检测波长450 nm处OD值并计算细胞存活率。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡情况 HBVEC以1×104个/孔接种于6孔板中,继续培养24 h后,用胰蛋白酶消化后收集细胞,按照凋亡检测试剂盒说明书操作,分别加入200 μl结合缓冲液重悬细胞,再分别加入5 μl膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)和碘化丙啶(PI),室温避光孵育20 min,快速使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7双荧光素酶报告基因检测circZNF652与miR-17-5p的靶向关系 携带circZNF652与miR-17-5p结合位点序列克隆至pMIR-REPORT荧光素酶报告质粒中,即合成野生型载体WT-circZNF652,用Quickchange XL位点定向诱变试剂盒构建突变体报告基因(MUT-circZNF652),HBVEC接种于96孔板(2×103个/孔),分别将miR-17-5p mimics、miR-NC质粒与WT-circZNF652或MUT-circZNF652共转染,48 h后收集细胞并检测细胞荧光素酶活性。

1.8Western印迹检测CHOP、Caspase-12蛋白表达 预冷RIPA裂解液用于提取各组HBVEC蛋白100 ℃条件下煮沸变性,10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行电泳分离蛋白,并进行转膜、封闭,在4 ℃条件下与CHOP(1∶1 000)、Caspase-12(1∶1 000)及内参GAPDH(1∶1 000)一抗共同孵育过夜,然后在室温条件下与二抗(1∶2 000)共同孵育1 h,用ImageJ软件分析蛋白条带。

1.9统计学处理 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1OGD诱导的HBVEC中circZNF652与miR-17-5p表达量比较 OGD组circZNF652水平(2.59±0.40)明显高于Con组(1.00±0.05;t=11.833,P<0.001),miR-17-5p水平(0.32±0.06)明显低于Con组(1.00±0.07;t=22.127,P<0.001)。

2.2干扰circZNF652对OGD诱导的HBVEC氧化应激、增殖及凋亡的影响 OGD组细胞LDH、MDA水平、凋亡率、CHOP、Caspase-12蛋白水平均明显高于Con组,SOD活性和存活率明显低于Con组;OGD+si-circZNF652组miR-17-5p水平、SOD活性、存活率明显高于OGD+si-NC组,LDH和MDA水平、凋亡率、CHOP、Caspase-12蛋白水平明显低于OGD+si-NC组(均P<0.05),见表1、图1、图2。

图1 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

1～8：Con组、OGD组、OGD+si-NC组、OGD+si-circZNF652组、OGD+miR-NC组、OGD+miR-17-5p组、OGD+si-circZNF652+anti-miR-NC组、OGD+si-circZNF652+anti-miR-17-5p组图2 Western印迹检测各组CHOP、Caspase-12蛋白表达

表1 干扰circZNF652对OGD诱导的HBVEC氧化应激、增殖及凋亡的影响

2.3miR-17-5p过表达对OGD诱导的HBVEC氧化应激、增殖及凋亡的影响 与OGD+miR-NC组比较,OGD+miR-17-5p组LDH、MDA、凋亡率及CHOP、Caspase-12蛋白水平明显降低,SOD活性和细胞存活率明显升高(均P<0.05),见图1、图2、表2。

表2 miR-17-5p过表达对OGD诱导的HBVEC氧化应激、增殖及凋亡的影响

2.4抑制miR-17-5p表达可部分逆转干扰circZNF652对OGD诱导的HBVEC氧化应激、增殖及凋亡的作用 与OGD+si-circZNF652+anti-miR-NC组比较,OGD+si-circZNF652+anti-miR-17-5p组miR-17-5p表达水平、SOD活性、细胞存活率明显降低,LDH、MDA水平、凋亡率及CHOP、Caspase-12蛋白水平明显升高(均P<0.05),见图1、图2、表3。

表3 抑制miR-17-5p表达可部分逆转干扰circZNF652对OGD诱导的HBVEC氧化应激、增殖及凋亡的作用

2.5circZNF652靶向调控miR-17-5p circZNF652与miR-17-5p存在结合位点,见图3。转染野生型载体WT-circZNF652细胞共转染miR-17-5p mimics后荧光素酶活性(0.29±0.04)较共转染miR-NC(1.01±0.04)明显降低(t=38.184;P<0.001),而转染突变型载体MUT-circZNF652细胞荧光素酶活性(1.01±0.04)较共转染miR-NC(1.00±0.03)无明显差异(t=0.600,P=0.557)。

图3 circZNF652靶向结合miR-17-5p

3 讨 论

circRNA具有普遍性、稳定性与特异性等特点,其基因序列上富含多个miRNA结合位点,可通过吸附miRNA而调节靶mRNA转录后水平,进而调控细胞生长及发育等生物学过程,目前circRNA在脑血管疾病中表达异常,并可能参与其发生及发展过程,如circ_2858在脑膜炎中上调,并可通过调控miR-93-5p而增加血管内皮生长因子(VEGF)A进而破坏血脑屏障〔8,9〕。沉默circRNA细胞周期依赖激酶抑制剂2B基因的反义非编码基因(ANRIL)通过充当miR-622的海绵分子而减轻氧葡萄糖剥夺/复氧诱导的人脑微血管内皮细胞损伤〔10〕。

有报道指出,circZNF652在肾癌、肝癌等肿瘤细胞中上调,并促进细胞恶性生物学行为〔11,12〕。本研究结果提示,circZNF652高表达量可能促进脑血管内皮细胞损伤。本研究与季兆洁等〔13〕结果相似,提示成功建立HBVEC损伤模型。本研究结果提示,干扰circZNF652表达可抑制氧化应激反应而减轻OGD诱导的HBVEC氧化损伤。当大脑损伤时会诱发氧化应激反应进而促使神经细胞凋亡,内质网是蛋白质合成与分泌的重要场所,当细胞出现氧化应激反应时可造成内质网生理功能紊乱而引发内质网应激,进而激活细胞凋亡途径最终促使细胞凋亡,CHOP是内质网应激的标志性蛋白,其表达水平升高可激活细胞凋亡途径,同时研究表明,内质网应激诱导的细胞凋亡途径与Caspase-12蛋白有关〔14,15〕。本研究结果提示,干扰circZNF652表达可通过抑制氧化应激、内质网应激而抑制细胞凋亡,并可促进细胞增殖进而保护OGD诱导的HBVEC损伤。本研究还提示,circZNF652可能通过调控miR-17-5p而损伤HBVEC。研究表明,LncRNA通过调节miR-17-5p/Toll样受体(TLR)4促进脂多糖诱导的巨噬细胞炎性损伤〔16〕。抑制LncRNA肺癌转移相关转录本(MALAT)1通过靶向miR-17-5p/叉头盒蛋白(FOX)A1轴可减轻脂多糖诱导的肺上皮细胞损伤〔17〕。miR-17-5p过表达通过靶向E2F1而抑制细胞凋亡从而减轻高糖诱导的内皮细胞损伤〔18〕。表明miR-17-5p高表达可能对细胞损伤发挥保护作用。本研究结果提示,circZNF652可靶向调控miR-17-5p而造成OGD诱导的HBVEC损伤。

综上,OGD诱导的HBVEC中circZNF652表达水平升高,miR-17-5p表达水平降低,干扰circZNF652表达可促进miR-17-5p表达,二者之间存在靶向调控关系,干扰circZNF652表达可通过上调miR-17-5p促进细胞增殖,并抑制氧化应激、内质网应激、凋亡进而减轻OGD诱导的HBVEC损伤,但其具体作用机制仍需进一步探讨。