两种柱前衍生法测定奶粉中牛磺酸的比较研究

康绍英 刘宇星 赵红清 李灿 刘兰 张新

摘 要：实验采用邻苯二甲醛和丹磺酰氯两种柱前衍生高效液相色谱法测定奶粉中牛磺酸的含量，并比较了两种方法的优劣。样品用水溶解除去蛋白质后，上清液用邻苯二甲醛和丹磺酰氯衍生，衍生产物经C18反相色谱柱分离，采用高效液相色谱法测定，以外标法定量。两种衍生化方法灵敏度好、分离度高，均可用于奶粉中牛磺酸的测定，但邻苯二甲醛法具有样品前处理快、分析时间短、干扰少等优点，是较理想的牛磺酸测定方法。

关键词：邻苯二甲醛；丹磺酰氯；柱前衍生；高效液相色谱法；牛磺酸

Comparison of Two Pre-Column Derivatization Methods for the Determination of Taurine in Milk Powder

KANG Shaoying， LIU Yuxing， ZHAO Hongqing， LI Can， LIU Lan*， ZHANG Xin

（Hunan Provincial Institute of Product and Goods Quality Inspection， Hunan Provincial Key Laboratory of Food Safety Monitoring and Early Warning， Changsha 410017， China）

Abstract： The content of taurine in milk powder were determined by high performance liquid chromatography with two kinds of pre-column derivatization by o-phthalaldehyde dansyl chloride. The advantages and disadvantages of the two methods were compared. After the samples were dissolved with water to remove the protein， the supernatant was derivatized with o-phthalaldehyde and dansyl chloride. The derivatives were separated by C18 reversed-phase column and determined by HPLC and quantified by external standard method. The two derivatization methods have good sensitivity and high resolution and can be used for the determination of taurine in milk powder. However， the o-phthalaldehyde method has the advantages of fast sample preparation， short analysis time and less interference， and is an ideal taurine determination method.

Keywords： o-phthalaldehyde; dansyl chloride; pre-column derivatization; high performance liquid chromatography; taurine

牛磺酸又名2-氨基乙磺酸、牛膽素、牛胆酸，因最早从牛黄中提取出来而得名。牛磺酸是一种含硫氨基酸，但并不是蛋白质的组成成分，这种非蛋白氨基酸不参与体内蛋白的生物合成，以游离氨基酸形式存在于人体内。作为一种特殊的氨基酸，其对人体健康非常重要，是人体必不可少的营养元素。研究表明牛磺酸具有保肝利胆、降低血压，调节内分泌、抗惊厥和心律紊乱、预防心脑血管疾病、抑制血糖升高、提高免疫力、抗疲劳等生理作用，特别是对婴幼儿提高智力发育、神经传导和视觉功能以及钙的吸收有着非常重要的作用，是一种促进婴幼儿生长发育的重要营养素。研究发现，婴幼儿如果缺乏牛磺酸，会导致中枢神经系统发育缓慢，造成智力低下、视觉功能紊乱等不良后果。牛磺酸广泛存在于人和动物的脑、心脏、肝、肾及乳汁中。婴儿主要从母乳中获得牛磺酸，而牛奶中几乎不含牛磺酸，所以完全由人工喂养的婴儿，可能会造成牛磺酸的缺乏，因此婴幼儿配方奶粉中必须强化添加一定量的牛磺酸。目前我国标准《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》（GB 14880—2012）中规定婴幼儿调制乳粉中牛磺酸的允许使用量为0.3～0.5 g·kg-1。

牛磺酸的主要检测方法有薄层色谱法[1]、酸碱滴定法[2]、比色法[3]、氨基酸分析仪法[4]以及柱前衍生高效液相色谱法[4-11]等，其中最常见的牛磺酸检测方法为柱前衍生高效液相色谱法。牛磺酸分子式中无共轭双键，在紫外区无吸收，需经衍生加入紫外吸光基团方可产生吸收，从而进行含量测定。用于测定牛磺酸的主要柱前衍生剂有邻苯二甲醛[5-7]、丹磺酰氯[4，8]、2，4-二硝基氟苯[9]、异硫氰酸苯酯[10]、9-氯甲酸芴甲酯[11]等。本研究采用邻苯二甲醛（OPA）和丹磺酰氯（Dansyl-Cl）两种柱前衍生高效液相色谱法测定奶粉中牛磺酸的含量，并比较了两种方法的优劣。两种衍生化方法灵敏度好、分离度高，均可用于奶粉中牛磺酸的测定，但实际样品分析表明OPA法具有样品前处理快、分析时间短、干扰少等优点，是较理想的牛磺酸测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

供试奶粉来源于流通领域抽取的食品安全监督抽检样品。

牛磺酸标准物质（国家标准物质信息中心）；甲醇、乙腈、盐酸甲胺、丹磺酰氯（色谱纯，CNW Technologies）；邻苯二甲醛（优级纯，国药）；乙硫醇（分析纯，Fluka Analytical）；硼酸（分析纯，上海山浦）；氢氧化钠（分析纯，天津风船）；亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、盐酸、无水碳酸钠、乙酸钠（分析纯，国药）。

LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司；BS224S电子天平、PB-10 pH计，北京赛多利斯科学仪器有限公司；KQ-500B超声波清洗机，昆山美美超声仪器有限公司；TG16-WS离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

（1）牛磺酸标准溶液。精密称取0.050 2 g牛磺酸标准物质于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，配成浓度为1 mg·mL-1的标准溶液。

（2）牛磺酸标准工作液。准确吸取适量牛磺酸标准溶液，用水稀释制备浓度为1 μg·mL-1、5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、15 μg·mL-1和20 μg·mL-1的系列标准工作液。

（3）沉淀剂Ⅰ。称取15.0 g亚铁氰化钾用水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

（4）沉淀劑Ⅱ。称取30.0 g乙酸锌用水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

（5）0.4 mol·L-1硼酸钠缓冲液。分别称取2.48 g硼酸、1.41 g氢氧化钠用水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

（6）OPA衍生剂。称取0.1 g OPA加10 mL甲醇溶解，再加0.1 mL乙硫醇，最后用0.4 mol·L-1硼酸钠缓冲液稀释至100 mL容量瓶中。

（7）1 mol·L-1盐酸溶液。吸取9 mL盐酸用水定容至100 mL容量瓶中。

（8）0.08 mol·L-1碳酸钠缓冲液（pH=9.5）。称取0.424 g无水碳酸钠以40 mL水溶解，用1 mol·L-1盐酸溶液调节pH值至9.5，再用水定容至50 mL容量瓶中。

（9）1.5 g·L-1丹磺酰氯溶液。称取0.15 g丹磺酰

氯，用乙腈溶解定容至100 mL容量瓶中。

（10）20 g·L-1盐酸甲胺溶液。称取2.0 g盐酸甲

胺，水溶解定容至100 mL容量瓶中。

（11）0.01 mol·L-1乙酸钠缓冲液（pH=4.2）。称取0.820 g乙酸钠，用水溶解稀释至1 000 mL容量瓶中，用冰乙酸调节pH值至4.2，经0.45 μm微孔滤膜过滤。

1.2.2 试样制备

（1）试液提取。称取1.0 g左右试样至100 mL容量瓶，加入80 mL 50～60 ℃温水溶解，充分混匀后超声提取10 min，冷至室温。加1.0 mL沉淀剂Ⅰ混匀，再加入1.0 mL沉淀剂Ⅱ混匀，用水定容并充分混匀，提取液于5 000 r·min-1离心10 min，取出上清液待衍生用。该上清液在4 ℃暗处可稳定保存24 h。

（2）试液衍生化。①OPA衍生化。准确吸取上清液2.5 mL、OPA衍生剂2.5 mL于10 mL具塞离心管中摇匀，衍生反应2 min后经0.22 μm微孔滤膜过滤，立即进样分析，标准工作液和样品溶液从衍生开始至上机分析的时间应尽量保持一致并控制在

5 min内。②丹磺酰氯衍生化。准确吸取上清液、碳酸钠缓冲液和丹磺酰氯溶液各1.00 mL于10 mL具塞玻璃试管中，充分混匀在室温条件下避光衍生反应2 h（中间振摇1次），加0.10 mL盐酸甲胺溶液摇匀终止衍生反应，避光静置沉淀取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤待分析用。衍生后的溶液在4 ℃避光条件下可保存48 h。标准工作液与样品溶液同步衍生。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，

5 μm）；OPA法流动相：乙腈∶水=10∶90；检测波长：335 nm；丹磺酰氯法流动相：10 mmol·L-1乙酸钠缓冲液∶乙腈=80∶20；检测波长：254 nm；流速：

1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

2.1.1 检测波长的确定

在碱性条件下牛磺酸与OPA衍生试剂发生衍生反应，生成具有紫外吸收的衍生产物。衍生产物光谱图显示在335 nm处具有最大吸收峰，因此OPA法检测波长为335 nm。同样在碱性条件下牛磺酸与丹磺酰氯发生衍生反应生成具有紫外吸收的衍生产物，该产物在254 nm处具有最大吸收，因此丹磺酰氯法检测波长为254 nm。

2.1.2 流动相的优化

OPA衍生法采用乙腈-水作为流动相，并分别考察了30%、20%、10%的乙腈-水对牛磺酸分离的影响，最终选择10%乙腈-水作为流动相，牛磺酸在6 min左右出峰，且样品检测无杂质干扰。

丹磺酰氯衍生法首先以10 mmol·L-1乙酸钠缓冲液∶乙腈=70∶30为流动相，实际样品分析时测得某奶粉牛磺酸含量为标签标示值的2倍，而用OPA衍生法测得其牛磺酸含量与标签标示值一致，进一步优化流动相比例发现该衍生方法衍生产物中存在干扰目标分析物检测的组分，且干扰物衍生产物的光谱图和牛磺酸衍生产物的光谱图完全一致，当乙酸钠缓冲液与乙腈的比例为80∶20时，干扰成分与目标物完全分离，测得奶粉样品中牛磺酸的含量与标签标示含量基本一致，因此丹磺酰氯衍生法以乙酸钠缓冲液∶乙腈=80∶20为流动相。

2.2 方法验证结果

2.2.1 方法的线性范围及检出限

将不同质量浓度水平的标准工作溶液分别采用两种衍生法衍生后于优化的色谱条件下依次进样分析，以分析物峰面积（Y）对质量浓度（X）绘制标准工作曲线，得到牛磺酸的标准曲线、线性回归方程及相关系数。由表1可知，两种方法在1～20 μg·mL-1线性关系良好，相关系数r分别为0.999 9和0.999 6，方法检出限均为1.5 mg/100 g，结果见表1。

2.2.2 回收率及重复性结果

分别称取1 g（精确至0.01 g）奶粉试样于100 mL容量瓶中，以3种浓度水平进行加标回收实验，每个浓度水平各分别制备5份测试溶液进行测定，分别计算各浓度添加水平的平均测定值、平均回收率和相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。由表2可知，两种方法均可获得较好的回收率，相对标准偏差≤4.30%。

2.3 两种方法优缺点讨论

OPA衍生剂是目前应用最为广泛的测定牛磺酸的柱前衍生试剂。实际样品检测表明OPA衍生法具有诸多优点，如OPA衍生剂本身不会干扰目标物的分离检测，过量试剂不必除去；衍生反应迅速，

2 min内即可完成；衍生产物出峰快，分析一个样品仅需10 min。但OPA衍生法的最大缺点是衍生产物不稳定，要求衍生反应结束后必须在很短的时间内完成进样分析，且每份样品的时间必须保持一致，因此严格控制衍生反应时间及进样分析时间是获得较好的重复性的必备条件；样品不能批量处理；衍生过程中需加入乙硫醇，乙硫醇气味大且毒性较大。如色谱仪配备有在线衍生系统，则可实现在线衍生化反应，能够很好地解决以上缺点。无在线衍生条件的实验室，只要衍生时间和进样时间控制好，也很容易获得满意的重复性。

衍生剂丹磺酰氯目前也被较多地应用于牛磺酸的测定中，该衍生法具有前处理操作简便、数据准确、重现性好等特点，其主要优点是衍生产物非常稳定，在4 ℃可避光保存48 h，样品能够批量处理。但此衍生法亦有不足之处，如衍生反应时间长，需要2 h；需加入淬灭剂终止反应以除去过量试剂；衍生产物干扰成分多，色谱分析时间较长。

3 结论

本实验比较了OPA和丹磺酰氯两种柱前衍生法测定奶粉中牛磺酸的检测方法。结果表明，两种方法线性关系良好，回收率高，灵敏度高，测定结果准确、重现性好，均可用于奶粉中牛磺酸的测定。但丹磺酰氯法衍生反应慢，分析耗时长、干扰多。与之相比OPA法具有样品前处理时间短、分析时间短、分离效果好等优点，其衍生产物不稳定、样品不能批量处理，但可运用在线衍生系统解决，是较为理想的牛磺酸测定方法。

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