UHPLC-Q-Exactive-MS/MS结合网络药理学分析泻肺利水汤的化学成分及治疗心力衰竭的作用机制

周德勇，龚韬＊，佟彤，娄妍，杨薇，胡银燕，刘红旭（1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；.北京市中医药研究所，北京 100010）

心力衰竭是各种心脏疾病严重或晚期的表现，是由多种原因导致的心脏或（及）心室结构、功能的异常改变或（及）障碍，从而引起主要表现为呼吸困难、疲乏和体液潴留等的复杂临床综合征[1]。好发于中老年人，且发病率呈逐年上升趋势[2]。中医药在稳定病情、改善功能和提高患者生活质量方面具有独特的优势[3]。泻肺利水汤是国家名老中医许心如教授根据《金匮要略》中葶苈大枣泻肺汤和防己黄芪汤主方加减而来的临床经验方[4-6]，通过调节全身气机、推动调节血液的运行，通调水道，治理调节津液的代谢。泻肺利水汤由黄芪、葶苈子、防己、桑白皮、香加皮组成，方中黄芪补益元气，扶正固本，该药补而不滞，兼有行湿之功；桑白皮、葶苈子、香加皮泻肺气行水，除胸中痰饮，化痰平喘利水；防己益气利水；诸药合用既能益气养阴，又能泻肺利水，化痰平喘。临床研究表明，泻肺利水汤能有效改善心力衰竭患者的临床症状、心功能和生活质量，但其治疗心力衰竭的活性成分及作用机制尚不清楚，故本研究采用UHPLC-Q-Exactive-MS/MS分析泻肺利水汤的化学成分，借助网络药理学构建“药物-疾病-靶点”相互作用网络，初步探究其治疗心力衰竭的主要活性成分及作用机制，为今后的临床研究和药物制剂开发提供参考。

1 材料

1.1 仪器

赛默飞Q-Exactive Orbitrap 四极杆-静电场轨道阱质谱仪（美国Thermo Scientific 公司）；Xcalibur 4.2化学工作站，XP105DR十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 试药

甲醇、乙腈为色谱纯（赛默飞世尔科技有限公司）；磷酸（色谱纯，天津市光复科技发展有限公司）；水为超纯水。4-甲氧基水杨醛（批号：DSTDJ015801）、杠柳毒苷（批号：DSTDG00401）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-龙胆二糖苷（批号：DSTDH008301）、防己诺林碱（批号：DST210829-005）、桑皮苷A（批号：DSTDS006801）（成都德思特生物技术有限公司，纯度均大于98%），黄芪甲苷（批号：0781-9706，纯度≥98%，中国食品药品检定研究院）。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

精密称取4-甲氧基水杨醛、山柰酚、杠柳毒苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-龙胆二糖苷、防己诺林碱、桑皮苷A、黄芪甲苷等对照品适量，加入甲醇分别制成质量浓度为20.03、21.47、25.15、26.09、25.17、23.14、21.96 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

按照泻肺利水汤处方组成称取黄芪12 g、南葶苈子12 g、桑白皮6 g、防己6 g、香加皮12 g于1000 mL圆底烧瓶中，加入10倍量水，提取2次，每次1 h，取续滤液，合并，减压浓缩干燥，即得。精密称定上述干燥粉末50 mg于10 mL量瓶中，加入适量甲醇，超声处理（功率250 W，频率30 kHz）30 min，放冷，加甲醇至刻度线，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得泻肺利水汤供试品溶液。

2.3 UHPLC-Q-Exactive-MS/MS 分析条件

2.3.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18 液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～20 min，3%→30%A；20～30 min，30%→40%A；30～45 min，40%→60%A；45～50 min，60%A；50～80 min，60%→90%A；80～85 min，90%A；85～86 min，90%→3%A；86～100 min，3% A），流速0.4 mL·min-1，柱温30℃，进样量10 µL。

2.3.2 质谱条件 热喷雾离子源（HESI）；离子源温度450℃，喷雾电压3.5 kV，S-LensRF 电压50 V，毛细管温度350℃，鞘气和辅助气均为高纯氮气（纯度大于99.99%），鞘气流速：30 arb，辅助气流速：12 arb。质谱采集范围为m/z100～1500，采集时间0～90 min，与数据依赖性二级质谱扫描ddMS2；分辨率：70 000（Full Scan），17 500（MS/MS）；碰撞模式：高能量碰撞解离（HCD），碰撞能量：NCE 30，Stepped NCE 50%。

2.4 泻肺利水汤水提液化学成分分析与鉴定

采用UHPLC-Q-Exactive-MS，对泻肺利水汤水提物样品进行正负离子全扫描，获得正负离子模式下的TIC图（见图1），通过与对照品的相对保留时间、准分子离子峰、MS/MS碎片离子信息等信息对比确认，结合参考文献[7-15]，共鉴定化合物82个，包括黄酮类37个，酚酸类10个，香豆素类7个，生物碱类5个，皂苷类5个，其他类18个。正负离子模式下均鉴定出的成分，表中仅列出负离子模式下化合物的离子碎片信息，具体结果见表1。

图1 泻肺利水汤水提物正（上图）、负（下图）离子模式下的TIC图Fig 1 TIC diagram of Xiefei Lishui decoction in positive ion（up）and negative ion（down）mode

续表1

2.5 网络药理学分析

2.5.1 药物活性成分及靶点收集 以胃肠道吸收（GI absorption）得分为“high”，类药性（druglikeness）至少得到2个“Yes”为依据，借助Swiss ADME平台对筛选出的化学成分进行筛选；将筛选出的化合物导入SwissTargetPrediction数据库预测各化学成分的作用靶点，以Probability大于0.1为筛选条件，共筛选得到活性成分37个，靶点1603个，删除重复靶点后共有470个。

2.5.2 疾病靶点预测筛选 以“heart failure”为关键词，在GeneCard、OMIM、DrugBank、TTD 4个数据库中检索，获取心力衰竭相关靶点，分别得到靶点5237、130、54、30个，在Genecard数据库中筛选得到的靶点过多，以大于2倍中位数的得分数为条件进行筛选后得到靶点1312个，将4个数据库的目标靶点合并，删除重复值。使用R语言将药物靶点与获得的疾病靶点进行整合，删除重复值后合并得到共同靶点1412个，取交集得135个。

2.5.3 药物-活性成分-疾病-靶点互作网络 将获得的交集靶点导入Cytoscape 3.9.0软件，构建“药物-活性成分-疾病-靶点”的调控图，共得到节点177个和关系603条，结果见图2，经计算degree值较高的化学成分分别是山柰素、甘草素、7-羟基香豆素、防己菲碱、黄芪紫檀烷苷。

图2 泻肺利水汤“活性成分-靶点”网络图Fig 2 “Active ingredient-target” network diagram of Xiefei Lishui decoction

2.5.4 PPI网络构建和核心基因预测 应用STRING网络平台，构建交集基因的PPI网络图，将其进一步利用Cytoscape 3.9.0构建网络分析图，并筛选关键靶点（见图3），图中共有节点140个，边1437条，根据degree值排序，处于核心位置的靶点为TNF、AKT1、EGFR、VEGFA、ESR1，提示这些靶点在泻肺利水汤治疗心力衰竭中发挥了关键作用。

图3 泻肺利水汤治疗心衰相关靶点的PPI 网络Fig 3 PPI network of the relevant targets of Xiefei Lishui decoction in the treatment of heart failure

2.5.5 GO功能富集和KEGG通路富集 通过Cytoscape 3.9.0软件计算活性成分-核心靶点及运行相关脚本后，进行基因功能注释（GO）富集分析和京都基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，GO中包括3个模块：生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF），筛选条件为P＜0.05；同样，Q＜0.05时获得的KEGG通路被认为是最重要的信号通路。通过GO富集分析共获得2329个富集结果，包括2084个BP，主要涉及激酶活性的正向调节、对MAPK 级联的正向调节、对外源性刺激物的反应、上皮细胞增殖等；共91个CC，主要涉及膜筏、膜微区、神经元细胞体、囊泡腔、分泌颗粒腔等；有154个MF，主要涉及内肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、丝氨酸水解酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等（见图4）。KEGG富集分析后，得到154条通路富集结果，主要涉及PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、癌症中的蛋白聚糖、Rap1信号通路等。提示泻肺利水汤可能通过上述信号通路对心力衰竭起到治疗作用（见图5）。

图4 GO富集分析Fig 4 GO enrichment analysis

图5 KEGG富集分析Fig 5 KEGG enrichment analysis

2.5.6 潜在核心活性成分-核心靶点分子对接预测 根据“药物-活性成分-疾病-靶标”网络中的degree值排序，结合文献，选取化合物中degree＞20的山柰素、甘草素、7-羟基香豆素、防己菲碱、黄芪紫檀烷苷等5个主要成分，分别与5个核心基因进行分子对接。一般认为结合能小于-5.0 kJ·mol-1，就表明分子与靶点之间有良好的结合活性，若小于-7.0 kJ·mol-1，则说明结合活性很强[16]，结果表明5个成分与核心基因均有良好的结合力，具体见表2。

表2 分子对接Tab 2 Molecular docking

3 讨论

心力衰竭是各种心脏病发病末期或严重临床阶段，主要表现为呼吸困难、心悸、疲乏、体液潴留等症状，充分缓解水钠潴留有效减轻患者症状、降低患者再住院率、提高生活质量的重要措施[1]。中医认为，其主要病机多为心肺气虚，气化不利，导痰湿内阻，治疗多以益气利水为法[17]。在此基础上，北京中医医院许心如教授提出“泻肺利水”法治疗心力衰竭的学术观点，并取得了良好的临床疗效[18]。为了进一步阐明泻肺利水对心力衰竭的治疗作用，本研究采用UHPLCQ-Exactive-MS/MS方法结合网络药理学方法，鉴定出泻肺利水汤水提物的化学成分82个，其中山柰素、甘草素、7-羟基香豆素、防己菲碱、黄芪紫檀烷苷等活性成分具有较多的作用靶点，是泻肺利水合剂治疗心力衰竭的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒等药理作用；现代研究表明，下调炎症因子的表达、减少氧化应激反应、调控细胞凋亡在心力衰竭的治疗中具有重要意义[19]。

通过PPI网络拓扑分析预测到AKT1、IL1B、TP53、TNF、VEGFA等5个核心基因。GO分析显示，泻肺利水治疗心力衰竭的生物过程集中在激酶活性的正向调节、对MAPK 级联的正向调节，其中还涉及对外源性刺激物的反应、对上皮细胞增殖的反应的调节等。KEGG 通路分析表明，内肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、丝氨酸水解酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性，可能是治疗机制中的重要通路。另外TNF信号通路是重要的炎症通路[17]。TNF-α广泛存在于心力衰竭患者活检组织中，被认为是心力衰竭疾病发生发展过程中的重要因子[20]。实验证明，抑制TNF-α信号通路表达能够改善心力衰竭大鼠的心功能，对心力衰竭的防治具有重要意义[21]。

综上所述，本研究充分考虑药物煎煮过程中可能发生的化学成分变化，采用UHPLC-Q-Exactive-MS/MS技术对泻肺利水汤化学成分进行了鉴定，并通过网络药理学和分子对接技术探讨了其治疗心力衰竭的主要活性成分及作用机制。研究结果表明泻肺利水汤可能是通过山柰素、甘草素、7-羟基香豆素、防己菲碱、黄芪紫檀烷苷等成分作用于AKT1、IL1B、TP53、TNF、VEGFA等靶点，进一步通过调控内肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、丝氨酸水解酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等信号通路发挥多成分、多靶点治疗心力衰竭的作用。