代茶冬青不同季节叶片营养成分分析

邹 薛,扈嘉鑫,袁虎威,章建红,郑炳松,闫道良*

1浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室,杭州 311300;2宁波市农业科学研究院,宁波 315040

代茶冬青(Ilexvomitoria)隶属于冬青科冬青属,是一种富含咖啡因和抗氧化成分的常绿灌木,其原产于美国东南部,其叶和嫩枝传统上用来制作健康饮料[1,2]。咖啡因是茶等饮料植物中含有的活性物质,寻找新的富含咖啡因植物资源,以代替茶等常规饮料植物,是保护和减轻原料植物压力的重要途径。代茶冬青因具有独特的活性物质咖啡因,近年来成为“茶”替代品的明星之物,具有巨大的经济和社会效益,开发和利用前景广阔。目前,国内外学者对代茶冬青的研究多集中于叶片化学成分方面[3,4],对其年生长周期营养成分含量及其变化鲜有报道。因此,本文以不同季节代茶冬青新鲜叶片为研究对象,采用冷冻干燥法,对其矿质元素和主要有机营养物质含量进行了测定和分析评价,以期为代茶冬青的产业化开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

凯式定氮仪(KND04A,上海昕瑞仪器仪表有限公司);石墨消解仪(HCA-100,上海叶拓科技有限公司);分光光度计(UV-1600,苏州赛力威仪器有限公司);电感耦合等离子体发射光谱仪(Elan DRC-e,赛默飞世尔科技有限公司);千分之一天平(JE1002,上海浦春计量仪器有限公司);脂肪测定仪(SZF-06A,上海秋佐科技有限公司);高效液相色谱仪(Agilent 1100,赛默飞世尔科技有限公司);酶标仪(800TS-SN,安捷伦科技(中国)有限公司);色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,Amethyst C18-H,Sepax);浓硫酸、过氧化氢、高氯酸、盐酸、浓硝酸(化学纯,扬州华富化工有限公司);蒽酮、无水葡萄糖、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、5 mg/L磷标准溶液、乙醇、磷酸、正亮氨酸内标溶液、17种氨基酸标准品(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);石油醚、乙腈、苯酚、冰醋酸、维生素C、无水乙酸钠(化学纯,上海泰坦化学有限公司)。

1.2 植物材料

选取经分类专家鉴定、健壮生长的6年生代茶冬青植株。栽植地位于浙江农林大学东湖校区茶园,土质为疏松的有机黄壤,海拔96 m。以代茶冬青植株当年生枝条上的叶为材料,分别采摘春季(4月)嫩叶、夏季(7月)成熟叶和秋季(10月)老叶,置于低温盒中,并迅速带回实验室,经低温冷冻干燥、粉碎后用于检测各项指标。

1.3 测定方法

代茶冬青叶片营养元素的测定按照国家标准或者行业标准。矿质元素中氮含量的测定采用凯式定氮法,磷含量的测定采用钼锑抗比色法,钾、钙、镁、硫、铁、锰、锌、铜含量的测定参照GB/T 5009.268-2016《食品中多元素的测定》;可溶性糖的测定采用蒽酮比色法[5];可溶性蛋白的测定参照GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》;粗脂肪的测定参照GB/T 5009.6-2016《食品中粗脂肪的测定》;维生素C的测定参照GB/T 5009.86-2016《食品中抗坏血酸的测定》。

氨基酸的测定采用高效液相色谱法:称取约1.0 g样本,加入25 mL0.1%苯酚和5 mol/L盐酸,进行研磨,烘干之后,加入2 mL 0.1 mol/L盐酸水溶液,过滤膜待衍生,再分别将100 μL上述待衍生的清液和100 μL氨基酸标准品溶液分别置于2 mLEP管中;向每个离心管中依次加入20 μL正亮氨酸内标溶液、100 μL(确保pH>7)三乙胺乙腈溶液、100 μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液,混匀后在25 ℃环境下放置1 h,分别往每个离心管里面加入1 mL正己烷,混合均匀后放置10 min。取稀释5倍的下层溶液经过滤后上机检测;色谱仪:Agilent 1100高效液相色谱仪,紫外检测器波长为254 nm,色谱柱:赛分Amethyst C18-H(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温:40 ℃,流速:1 mL/min,进样体积:10 μL,流动相A:由6.6 g无水乙酸钠、950 mL蒸馏水、70 mL冰醋酸、70 mL乙腈组成的混合溶液,流动相B:80%乙腈水溶液。按下列洗脱梯度洗脱:0～2 min,100%A;2～15 min,100%A→90%A;15～25 min,90%A→70%A;25～33 min,70%A→55%A;33～38 min:55%A→0%A;35～45 min:0%A→100%A。氨基酸计算方法为各种氨基酸浓度(μg/mL)=F1/F2×C,其中F1为样本溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积,F2为混合氨基酸标准品溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积,C为混合氨基酸标准品中各氨基酸浓度。

1.4 数据处理方法

1.4.1 适用性检验

采用相关系数矩阵直观检验,计算氨基酸之间的Pearson相关系数,依据相关系数矩阵中相关系数的大小得出原始变量之间的线性关系,以此来进行适用性检验[6]。

1.4.2 主成分分析法

主成分分析,是考察多个变量之间相关性的一种多元统计分析方法,也就是从原始变量中选取少数几个变量尽最大可能保留原始变量的相关信息[7-10]。本试验采用主成分分析法研究代茶冬青叶片中氨基酸的种类与含量,为代茶冬青叶片的开发利用及加工提供理论依据。

1.5 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 代茶冬青叶片矿质营养元素变化

对春、夏、秋3个季节的叶片主要元素含量测定与分析表明(见表1),常量元素氮(N)、磷(P)、钾(K)、镁(Mg)、钙(Ca)和硫(S)含量变化范围分别为11.892～17.002、0.716～1.886、12.513～14.009、1.753～2.943、3.736～5.466和0.753～1.400 g/kg;微量元素中铁(Fe)、锰(Mn)、锌(Zn)和铜(Cu)含量变化范围分别为66.823～81.090、693.243～1512.076、181.996～276.173和11.270～12.210 mg/kg。

表1 代茶冬青不同季节叶片矿质营养元素含量

代茶冬青叶片矿质元素含量在不同季节采摘总体表现为春季最高,秋季最低。春季叶片中N、P、Fe、Mn显著高于夏季与秋季(P< 0.05),其中N含量高达17.002 g/kg。夏季的S含量显著高于春季和秋季;秋季的Ca含量显著高于春季和夏季;春季和秋季K、Mg、Zn、Cu含量差异不显著;春、夏、秋三个季节K、Cu含量差异不显著。综上结果表明,春季采摘的嫩叶具有较为丰富的矿质元素。

2.2 代茶冬青叶片主要营养成分变化

对春、夏、秋3季的代茶冬青叶片可溶性糖、可溶性蛋白、粗脂肪和维生素C的含量测定与分析表明,不同采摘季节叶片的营养成分差异显著(见表2)。可溶性糖、可溶性蛋白、粗脂肪和维生素C含量变化范围分别为269.808～447.786、13.163～28.959、1.986～3.046和17.106～29.101 mg/g。春季可溶性糖、可溶性蛋白和粗脂肪含量均最高,分别为447.786、28.959和3.046 mg/g,进入夏季后,含量呈现下降趋势,进入秋季这三者的含量又分别提高为324.657、16.175和2.401 mg/g。维生素C含量在秋季最高,为29.101 mg/g,总的来说,在不同采摘季节这4种营养物质变化较为明显,春季采摘嫩叶是获取这4种营养物质含量最高的最佳时期。

表2 代茶冬青不同季节叶片营养成分含量

2.3 代茶冬青叶片氨基酸含量变化

如表3所示,在春季,叶片氨基酸含量最高的是精氨酸,为402.807 μg/g,最低的是甲硫氨酸,为21.618 μg/g。在夏季,叶片氨基酸含量最高的是天冬氨酸,为324.169 μg/g,最低的是半胱氨酸,为11.955 μg/g。在秋季,叶片氨基酸含量最高的是异亮氨酸,为116.341 μg/g,含量最低的是组氨酸,为9.281 μg/g。叶片总氨基酸含量最高的是春季,为1 645.139 μg/g,其次是夏季,为1 425.104 μg/g,最低的是秋季,为554.806 μg/g。叶片中人体必需氨基酸含量最高的是春季,为571.620 μg/g,其次是夏季,为394.809 μg/g,最低的是秋季,为225.185 μg/g。综上,代茶冬青叶片中17种氨基酸含量在春季采摘含量呈现最高,在秋季采摘则最低,两者差异显著(P< 0.05)。

表3 代茶冬青不同季节叶片氨基酸含量

2.4 代茶冬青叶片氨基酸相关性分析

由表4可知,17种氨基酸之间具有不同程度的相关性,其中Asp与Glu、Ser、His、Lys、Thr之间,Glu与Ser、His,Ser与His之间,Gly与Ala、Ar、Tyr、Pro、Tyr、Val、Met、Cys、Leu之间,His与Thr、Pro、Tyr、Val、Met、Cys、Leu之间,Arg与Pro、Val、Cys、Ile之间,Thr与Lys、Leu、Ile、Val之间,Ala与Lys、Leu、Ile、Val之间,Pro与Tyr、Val、Met、Cys、Ile、Leu、Phe之间,Phe与Ala、Pro、Tyr、Val、Lys、Leu之间,Lys与Phe之间均呈极显著正相关(P<0.01)。Thr与Gly之间,Ala与His、Arg之间,Pro与Thr之间,Tyr与Arg之间,Met与Arg、Thr、Ala、Pro、Tyr、Val之间,Cys与His、Arg、Thr、Pro、Val之间,Ile与Ala、Met之间,Leu与Met之间,Phe与Met、Ile之间,Lys与Glu、Tyr、Val、Met、Leu之间呈显著正相关(P<0.05),其他氨基酸之间没有呈现明显的相关性。由于不同氨基酸之间相关性信息复杂,不能够直观评价叶片氨基酸营养品质,因此采用主成分分析,以此来直观地反映研究对象并对其作出客观的评价,便于研究代茶冬青叶片的营养品质。

2.5 叶片氨基酸主成分分析

对3个季节代茶冬青叶片中17种氨基酸进行主成分分析,由图1、图2、表5可知第1主成分方差贡献率占总变异信息的64.490%,第2主成分方差贡献率占总变异信息34.395%,累计方差贡献率达到98.885%,代表了叶片17种氨基酸的绝大部分信息,可以反映17种氨基酸的综合性状,因此选择前2个主成分作为综合指标对其品质进行综合评价。

图1 代茶冬青不同季节叶片氨基酸主成分提取碎石图

图2 代茶冬青不同季节叶片氨基酸主成分图

表5 代茶冬青不同季节叶片氨基酸主成分的初始特征值及累计方差贡献率

由表6可知Gly、Ala、Phe、Pro、Tyr、Met、Cys、Val、Leu、Ile、Lys和Arg在第1主成分上有较大的载荷,载荷系数分别为0.913、0.996、0.971、0.953、0.998、0.897、0.563、0.975、0.999、0.814、0.889和0.761,说明第1主成分基本代表了这些氨基酸的信息;Asp、Glu、Ser、His和Thr在第2主成分上有较大的载荷,载荷系数分别为0.903、0.973、0.860、0.976和0.577,说明第2主成分反映了这些氨基酸的信息,因此选择前2个主成分作为综合指标对其氨基酸品质进行综合评价。

表6 代茶冬青不同季节叶片氨基酸主成分载荷矩阵

以特征值的贡献率大小为分配系数[11-13],计算出每个主成分的特征值与所提取主成分总的特征值之和的比例,以此作为权重,最后得出主成分综合得分模型:

F1=0.130Asp+1.823Glu+0.215Ser+0.031Gly+0.045His+0.237Arg+0.051Thr+0.311Ala+0.297Pro+0.311Tyr+0.304Val+0.280Met+0.176Cys+0.254Ile+0.312Leu+0.302Phe+0.277Lys。

F2=0.373Asp+0.402Glu+0.356Ser-0.164Gly+0.404His-0.266Arg+0.239Thr+0.0261Ala-0.121Pro-0.101Tyr-0.088Val+0.169Met-0.321Cys-0.236Ile-0.012Leu+0.097Phe+0.185Lys。

对其按综合主成分分值进行排序,即可对不同季节叶片营养进行综合评价比较,结果见表7。

表7 代茶冬青不同季节叶片氨基酸主成分得分和综合得分

由表7可以得出,在第1主成分中,3个季节叶片得分最高的是春季,最低的是秋季,即春季中Gly、Ala、Phe、Pro、Tyr、Met、Cys、Val、Leu、Ile、Lys、Arg含量较高;第2主成分中,得分最高的是夏季,即夏季Asp、Glu、Ser、His、Thr含量较高。3个不同季节代茶冬青叶片所含氨基酸综合评价得分按从高到低排序依次为夏季、春季、秋季。夏季的综合评价得分最高,说明夏季叶片氨基酸综合品质较高,秋季的综合评价得分最低,其氨基酸综合品质较低。

3 讨论与结论

作为饮品的“茶”叶中各生化成分的含量受“茶”树品种、季节、自然环境等影响较大,不同季节“茶”叶各生化成分存在明显的差异和一定的变化规律[14-16]。我们对代茶冬青叶片各生化成分分析表明,矿质元素中N、P、Fe、Mn含量春季最高,因为春季是树叶生长的时期,营养状况良好,且营养元素向新生叶片转移[17];K元素含量虽然在生长期内逐渐降低,但变化幅度较小,表明代茶冬青叶片K元素受季节影响不大;其次数据分析可得春季和秋季代茶冬青叶片中Zn和Cu含量都高,Zn和Cu是蛋白质的组成成分,这可能春季和秋季蛋白质含量都高有关[18]。可溶性糖、氨基酸等含量在不同季节间存在显著差异,其中可溶性糖、可溶性蛋白春季最高、夏季最低,这与Huang等[19]的研究的结果一致。这可能是因为植物刚开始复苏生长的时候需要更多营养物质流向嫩叶。在夏季,植物的新陈代谢加快,营养元素被消耗,糖类、蛋白类物质被分解转化,所以可溶性糖、可溶性蛋白含量减少。秋季代谢减弱,物质开始积累,可溶性蛋白含量增加。同时春季氨基酸含量最高,这与前人对“黄金茶”成分研究结果一致[20],原因可能是春季气温适中,浙江雨水充沛,加上茶树经过秋冬季节较长时间的休养生息,内在成分及含量较为丰富,特别是氨基酸含量。此外有研究认为氨基酸含量高,且含有一定量的咖啡因是适宜制绿茶的品种特征要求[21,22]。氨基酸是茶叶的主要化学成分之一,其含量与绿茶品质呈正相关[23-25],加上春季芽叶色泽翠绿,香气浓烈,可以说代茶冬青作为春茶采摘是一年当中最优质的茶,而秋季的氨基酸含量低于春夏季,这与Zhou等[26]对茶的生化成分研究结果一致,原因可能是因为秋季茶树历经春夏两个季节的采收,缺乏体内营养物质。因此针对代茶冬青开发为茶叶利用时,春季采摘是开发利用最适宜的季节。

本文通过对代茶冬青叶片营养成分进行测定与分析,研究结果表明代茶冬青春季叶片中含有较高的矿质元素、可溶性糖、可溶性蛋白和粗脂肪。利用主成分分析法对代茶冬青3个季节叶片氨基酸进行分析,得到2个主成分。以方差贡献率为权重,依据各主成分得分值与方差贡献率建立综合评价模型,得到不同季节叶片氨基酸含量的综合得分,氨基酸含量综合评价得分排序为夏季>春季>秋季。综上所述,春季营养物质含量最高,夏季叶片氨基酸较为丰富,秋季代茶冬青叶片中含有较高的维生素C。因此在实际生产中,可根据需求选择不同季节代茶冬青叶片开发成多种产品。