基于靶点机制的抗阿尔茨海默病天然活性成分研究进展

黄丹蓉,程亚敏,冯紫涵,申刚义

中央民族大学药学院 民族医药教育部重点实验室(中央民族大学),北京 100081

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种神经系统退化性疾病,多发于65岁以上老年人群[1]。AD临床早期表现为短期记忆障碍,而后逐渐加重,并伴有语言、认知、定向和判断等多功能障碍,严重影响患者日常生活能力甚至危及生命[2]。国际AD协会发布的《2021年世界AD报告》中显示[3],全球痴呆症患者约5 500万,预计每年新增1 000万,而由AD导致的痴呆约占痴呆人数的64%。我国现有AD患者近1 000万,是全球患者最多的国家,预计2050年将超4 000万。随着全球人口老龄化进程加速,AD 已不仅是重要的公共卫生问题,还会引发严重的社会问题[4]。

AD起病隐匿且病情发展不可逆,当前临床用AD药物仅能延缓疾病进程,无法逆转病情,并有一定程度的副作用[5]。研发高效低毒的抗AD药物仍是全球医药界面临的严峻挑战。AD的病理特征主要为大脑皮质和海马区形成的β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)为核心的细胞外老年斑、细胞内异常磷酸化的tau蛋白为核心的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)以及神经元的丢失[3]。然而时至今日,AD发病机制尚未完全明晰,基于AD的病理特征,主要包括Aβ学说、tau蛋白学说、胆碱能损伤学说、免疫炎症学说和肠道微生物群等多种[6-8],表明AD病机复杂,发生发展涉及多种机制。基于不同机制靶点的药物研发策略已成为当前抗AD药物的主要研究方向。

天然产物中蕴涵海量多样化的活性成分,具有多组分、多靶点作用的特色和优势,符合AD多因素、多种病理机制的神经系统变性病发病特点。随着现代化分离鉴定技术的不断优化,从天然产物中筛选发现高效、高选择性、低毒性的靶向抗AD活性成分是抗AD药物研发的重要途径之一[9]。本文以当前AD药物研发的单靶点和多靶点筛选策略[10]为基础,结合AD发病机制中涉及到的各种靶点,对近年来天然产物中发现的抗AD活性成分进行评述和总结,以期为研发高效抗AD药物提供参考。

1 单靶点抗AD活性成分

1.1 靶向Aβ的抗AD活性成分

Aβ蛋白是淀粉样老年斑的主要成分,由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)通过病理途径水解产生。β-分泌酶1(β-site amyloid precursor protein cleaved enzyme1,BACE1)是一种具有APP催化活性的跨膜天冬氨酸蛋白酶,可对通过β位点的APP进行裂解,是合成Aβ的关键靶点[11]。在BACE1抑制剂的筛选中,黄酮类化合物凭借其出色的抑制活性,可作为BACE1抑制剂的天然骨架。Youn等[12]通过生物学评价和分子对接研究了5种异黄酮类成分对BACE1的抑制作用,发现染料木素(1,见图1和表1)抑制作用最强,IC50值为63 μmol/L,抑制类型为可逆非竞争性抑制。分子对接结果表明染料木素可通过氢键与BACE1中的重要氨基酸残基如ASN37、GLN73和TRP76发生相互作用。他们还发现了凹唇姜中3种活性成分对BACE1的抑制作用,显示小豆蔻明(2)的抑制性最强,IC50值为4.35±0.38 μmol/L,其次为乔松素(3)和球松素(4),3种成分均为非竞争性抑制活性[13]。此外,Youn等[14]还重点研究了小花山奈提取物中的黄酮类化合物,发现多甲氧基黄酮(5)对BACE1的抑制作用最强,IC50值为36.9 μmol/L,且该化合物可透过血脑屏障,具有良好的开发前景。

表1 单靶点抗AD天然活性成分

图1 单靶点抗AD天然活性成分的化学结构式(1～29)

APP被BACE1切割后产生可溶性β-APP和含有99个氨基酸残基的跨膜片段C99,而γ-分泌酶在多个位点切割C99以生成异质Aβ物种。但由于γ-分泌酶底物具有广泛性,且γ-分泌酶抑制剂药物都面临低效、血脑屏障渗透性差或严重的副作用,因此靶向γ-分泌酶的药物开发非常具有挑战性[15],而天然产物中海量丰富的活性成分为大规模筛选γ-分泌酶抑制剂提供了便利条件。Lei等[16]筛选了417种天然产物,发现双氢麦角汀(6)可抑制细胞中γ-分泌酶的活性从而降低Aβ肽的产生,构效关系研究表明抑制γ-分泌酶的关键结构是其环化三肽部分。Luo等[17]则通过光激活荧光探针发现3-O-反式对香豆酰基山楂酸(7)可选择性地影响γ-分泌酶的S1位点从而抑制γ-分泌酶,且可减少AD转基因模型小鼠产生的Aβ,减轻突触损伤。

Aβ的生成和聚集会加速AD患者的认知缺陷,且会产生神经毒性[18]。除了靶向参与Aβ形成的分泌酶可以防止Aβ生成外,还可以阻断Aβ分子内和分子间相互作用,诱导异常Aβ聚集体的构象变化,抑制Aβ聚集。研究表明多酚类成分具有抗Aβ变性活性。多酚类中的苯环可以针对Aβ疏水核心结构域中的苯丙氨酸残基,与Aβ形成疏水作用或氢键,破坏Aβ结构,抑制其神经毒性[19]。Ginnalin A(8)是从红枫中分离出的一种多酚化合物,Fan等[20]采用实验和计算模拟相结合的方法,发现该活性成分不仅能以较低剂量与Aβ单体结合以抑制其聚集,还能与Aβ聚集体的多个位点结合将其解离为无毒的小颗粒聚集体。Choi等[21]发现穗花杉双黄酮(9)可直接破坏预先形成的Aβ1-42原纤维结构,导致这些原纤维转化为无定形的Aβ1-42聚集体,并且在分解Aβ1-42原纤维方面表现出强抑制性,其IC50值为0.26 μmol/L。Marinelli等[22]发现藤黄酸(10)可显著降低AD小鼠星形胶质细胞中Aβ的聚集和沉积,其作用机制包括特异性激活孕烷X受体(pregnane x receptor,PXR)以及上调载脂蛋白E(apolipoprotein,ApoE)和P-糖蛋白(p-glycorprotein,P-gp)的表达。

1.2 靶向tau蛋白的抗AD活性成分

tau蛋白是一种主要在神经元中表达的微管相关蛋白,用于稳定神经元细胞骨架。异常磷酸化的tau蛋白会从微管中分离并聚集,形成成对的螺旋丝和NFTs,破坏微管稳定性,导致神经变性[23]。其中,参与调节tau蛋白过度磷酸化的关键酶主要包括细胞周期素蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase 5,CDK5)、糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase,GSK3β)和蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)。

CDK5及其协同激活剂CDK5-p25已被证明可诱导tau磷酸化和神经元凋亡[24]。Shen等[25]研究发现,槲皮素(11)对冈田酸诱导的HT22细胞tau蛋白过度磷酸化具有抑制作用。Western blot结果显示槲皮素可显著降低OA诱导的Ser396、Ser199、Thr231和Thr205位点的tau蛋白过度磷酸化,表明其抑制了CDK5的活性,并可阻断Ca2+-钙蛋白酶-p25-CDK5信号通路。此外,研究发现丹参酮ⅡA(12)能降低Aβ25-35诱导的tau磷酸化表达,改善细胞超微结构的损伤,而该保护机制涉及Ca2+-钙蛋白酶-p35-CDK5信号通路[26]。

GSK3β是一种在中枢神经系统中高度表达的丝氨酸/苏氨酸激酶,参与包括tau磷酸化和凋亡的多种细胞过程,其活性几乎与AD的所有阶段都相关[27]。钩吻碱(13)是一种从钩吻中提取的吲哚类生物碱,Chen等[28]评估了钩吻碱对Aβ低聚物诱导的小鼠认知障碍模型的治疗作用,发现极低浓度的钩吻碱(5～10 μg/kg)可显著抑制GSK3β表达。Pares等[29]通过分子对接和动力学模拟方法发现海洋天然产物Meridianin A(14)是GSK3β的ATP竞争性抑制剂,Lignarenone B(15)则为GSK3β的非ATP竞争性抑制剂。而后细胞实验证实了这两个化合物对GSK3β的抑制性,发现二者还能增加神经元细胞的可塑性。

PP2A占人类大脑中70%以上的tau磷酸酶活性,在细胞凋亡、细胞骨架动力学和Wnt信号通路的调节中发挥关键作用[30]。Zhang等[31]采用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)诱导的C57/BL6小鼠的tau蛋白表达,发现党参多糖显著增加了PP2A活性,降低了Ser199、Ser202/Thr205(AT8)和Thr231处的tau磷酸化,揭示其可能通过恢复突触可塑性和突触发生来减轻AD样认知损伤。Zhou等[32]探究了重楼皂苷Ⅰ(16)在蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A,CIP2A)过度表达的HEK293细胞和3XTg AD小鼠模型中的作用,体内外实验结果均证明了其可通过调节CIP2A/PP2A通路降低CIP2A的表达激活PP2A,防止tau/APP的过度磷酸化和Aβ过度产生,从而改善认知功能。

由于异常的翻译后修饰,tau蛋白会从微管分离并自组装,导致其聚集形式在细胞中积累增加,而错误折叠和聚集的tau蛋白会在神经元之间扩散从而加重AD进程[33]。Zhang等[34]发现黄腐酚(17)可抑制tau蛋白聚集并分解tau纤维,且能够抑制tau寡聚体诱导的细胞凋亡,为黄腐酚开发成AD药物提供了依据。Alali等[35]通过体外和电子生物化学方法研究大麻二酚(18)对重组人tau蛋白1N/4R亚型聚集的影响,显示其可以抑制tau原纤维的形成,大麻二酚主要基于范德华力和疏水力与tau蛋白发生相互作用。

1.3 靶向胆碱能系统的抗AD活性成分

乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)是所有胆碱能神经元使用的神经递质,存在于整个神经系统中,对大脑皮质发育和活动、脑血流控制、睡眠-觉醒周期以及学习记忆过程至关重要[36]。胆碱酯酶(cholinesterase,ChE)是胆碱能神经系统中的关键酶,可在突触和神经肌肉连接处迅速将ACh分解。根据作用底物的特异性,ChE可分为乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)和丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase,BChE)。ChE抑制剂可减少ACh的分解,提高其在突触间隙的含量,增强突触激活,改善胆碱能传递。

天然产物中广泛分布着抗ChE的活性成分,包括生物碱类、香豆素类、黄酮类、醌类、二苯乙烯类、萜烯类、氧杂蒽酮类等,特别是生物碱成分表现出优异的AChE抑制活性[37]。Zhang等[38]从水马桑乙酸乙酯部位中分离得到6个香豆素类AChE抑制活性成分,其中抑制作用最强的是臭矢菜素B(19),IC50值为3.32±0.01 mmol/L。Dastan等[39]从假蒜臭阿魏中分离得到了Kamonolol acetate(20),它与AChE活性位点的CAS和PAS均相互作用,其IC50值为63.9 μmol/L。Wang等[40]从57种中药提取物中发现鸡屎藤的乙酸乙酯部位具有较强的BChE抑制活性,主要活性成分为鸡屎藤苷(21)、鸡屎藤苷酸、甲基鸡屎藤苷等环烯醚萜苷类化合物。Topcu等[41]则从41种松香烷二萜类化合物中筛选出Bractealine(22)和Hypargenin-E(23)对BChE抑制活性最强,其IC50值分别为3.43和6.93 μmol/L。

1.4 靶向MAO的抗AD活性成分

单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)是导致AD患者出现氧化应激,进而使其行为和心理出现症状的几种酶之一[42]。MAO的过度表达会致使认知功能障碍,破坏胆碱能神经元,引发胆碱能系统紊乱,并导致淀粉样斑块和NFT的形成[43]。根据MAO的生理特征和作用机制,MAO抑制剂可分为MAO-A抑制剂和MAO-B抑制剂。其中,MAO-A抑制剂主要用于治疗抑郁症和焦虑症,而抑郁症是伴随AD最常见的神经精神症状之一;MAO-B抑制剂可减少神经毒性化合物如醛类和H2O2的产生,降低活性氧水平并提高神经元存活率,主要用于治疗AD和帕金森病[44,45]。

鉴于现有合成的MAO抑制剂存在严重的不良反应等安全性问题[46],开发天然MAO抑制剂十分重要。MAO抑制剂类型多样,包括生物碱、咖啡酸、香豆素、酯类、类黄酮、脂肪酸、糖苷类、吡喃酮和苯并吡喃酮、萜类和蒽酮类等[47]。Wu等[48]采用固定化MAO-B结合HPLC-MS技术,从金银花提取物中首次筛选出异绿原酸A(24)和异绿原酸C(25)两种MAO-B抑制剂,IC50值分别为29.0535±0.49 和29.77±1.03 μmol/L,酶动力学研究表明它们是可逆性的混合型抑制剂。Chaurasiya等[49]发现高良姜的二氯甲烷部位具有明显的MAO抑制作用,其中去甲氧基醉椒素(26)抑制力最强,对MAO-A和MAO-B的IC50值分别为1.850±0.0086和0.1233±0.0095 μmol/L。酶反应动力学实验和分子模拟研究显示去甲氧基麻醉椒素与MAO-A和MAO-B为可逆结合。与MAO-A相比,该成分与MAO-B的亲和力是前者的30倍。

1.5 其他类靶标的抗AD活性成分

流行病学研究表明,性别差异与AD的发生和发展密切相关,特别是女性约占AD患者的2/3,且绝经后女性患AD的风险更高[50]。性类固醇激素是神经功能的有效调节剂,靶向雌激素受体(estrogen receptor,ER)的ERβ亚型的选择性激动剂能改善认知障碍[51]。广藿香醇(27)是从广藿香中提取的三环倍半萜化合物。作为选择性ERβ激动剂,其可通过ERβ/TLR4途径促进小胶质细胞对Aβ1-42的吞噬作用减少Aβ斑块沉积,也通过ERβ/BDNF/TrkB/CREB信号传导促进突触相关蛋白VAMP2和PSD95,通过增加过氧化氢酶的表达来改善氧化应激[52]。

P-gp是一种由MDR1基因编码的细胞膜蛋白。在大脑中,其主要表达在血脑屏障内皮细胞基底侧,可调节多种内源性和外源性化合物从中枢神经系统排出[53]。自20年前首次将Aβ确定为P-gp底物以来,大量研究表明P-gp活性受损与Aβ沉积相关[54],而增强脑内P-gp的表达是降低AD患者脑中Aβ水平的有效途径[55]。Fascaplysin(28)是一种从海绵Fas caplysinopsis sp.中分离的吲哚类生物碱活性成分,Manda等通过细胞实验发现其可作为P-gp的有效诱导剂[56]。

糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)可与Aβ相互作用,通过激活神经炎症通路诱导神经元功能障碍引发Aβ通过血脑屏障转运,是治疗AD的潜在靶点[57]。Guan等[58]通过细胞和动物实验发现薯蓣皂苷(29)具有优异的抗AD作用。显示薯蓣皂苷通过抑制RAGE下调与炎症反应和氧化应激密切相关的NADPH氧化酶4的表达水平,进而上调与氧化应激相关的Nrf2和HO-1的表达,并下调部分炎症因子的表达,通过调节RAGE/NOX4途径实现抗AD的作用。

2 多靶点抗AD活性成分

AD发病过程涉及多种机制的生化途径,考虑到多个途径之间复杂的相互关系,基于多靶点协同作用机制的筛选策略更具前景[59]。目前,国内外学者已从天然产物中发现多种具有多靶点抗AD作用的活性成分,对于抗AD药物研发具有重要意义。

2.1 靶向Aβ和tau的抗AD活性成分

蓝萼甲素(30,见图2和表2)是一种从冬凌草中提取得到的对映型月桂基二萜,Zhou等[60]发现其可通过抑制BACE1和AKT/mTOR信号通路来提高Aβ的清除率,同时涉及抑制mTOR/p70S6K通路的tau磷酸化。揭示蓝萼甲素在促进Aβ清除和降低tau磷酸化的双重靶向作用。Das等[61]发现姜黄素(31)可下调GSK3β和CDK5的表达,降低AD大鼠的tau蛋白磷酸化水平,还可消除AD大鼠的Aβ40和Aβ42斑块,逆转AD大鼠受损的记忆和活动能力。

表2 多靶点抗AD天然活性成分

图2 多靶点抗AD天然活性成分的化学结构式(30～50)

Rhizolutin(32)是一种从人参根部土壤细菌分泌得到的具有三环结构的新型化合物。Kwon等[62]发现Rhizolutin可显著解离APP/PS1小鼠海马Aβ斑块,还能抑制tau蛋白聚集,继而减少下游的细胞凋亡和炎症反应。Gu等[63]发现安五脂素(33)可上调PP2A活性,显著降低SH-SY5Y/Tau和HEK293/Tau过度表达的细胞系中蛋白Thr231、Ser396和Ser404位点的过度磷酸化。此外,安五脂素还可激活PERK/eIF2α信号通路减少BACE1表达,抑制N2a/SweAPP细胞中的Aβ沉积。

2.2 靶向Aβ和胆碱能系统的抗AD活性成分

Nuthakki等[64]从白花酸藤果中筛选发现活性成分Embelin(34)可以通过抑制BACE1来阻止Aβ低聚物形成同时加快Aβ的清除,还可通过抑制ChE来改善胆碱能传递,具有多重靶向机制。对AChE、BChE和BACE1的抑制性能的IC50值分别为2.5、5.4和2.1 μmol/L。Panche等[65]则通过计算机模拟和体外实验相结合的方法发现来自穿心莲的化合物3,4-二咖啡酰奎宁酸(35)、芹菜素(36)和7-O-methylwogonin(37)同时具有ChE和BACE1强抑制性能,对AChE、BChE和BACE1的IC50值分别为2.14±0.04、1.44±0.02、3.31±0.12 μmol/L;3.42±0.02、1.97±0.01、3.79±0.26 μmol/L;2.46±0.03、2.88±0.01、2.91±0.04 μmol/L。

Augustin等[66]发现RumexabyssinicusJacq.的乙酸乙酯提取物同时对AChE和BChE具有抑制性,其中活性成分Helminthosporin(38)对AChE和BChE的抑制力最强,IC50值分别为2.63 μmol/L和2.99 μmol/L。通过平行人工膜体外渗透技术发现helminthosporin具有较高的血脑屏障渗透性,其渗透率为6.16 × 10-6cm/s。Cakmak等[67]发现二苯并呋喃衍生物松萝酸(39)对AChE和BChE显示出更强的抑制活性,IC50分别为1.273 nmol/L和0.239 nmol/L,为研发抗AD新药提供了重要依据。

2.3 靶向胆碱能系统和氧化应激的抗AD活性成分

二氢杨梅素(40)是一种天然二氢黄酮醇,Sun等[68]发现二氢杨梅素治疗后的D-半乳糖诱导的ICR小鼠脑内和肝脏组织中的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化酶的活性显著提高,减轻了D-半乳糖造成的氧化应激损伤。此外,二氢杨梅素作为AChE的非竞争性抑制剂,还可抑制小鼠脑内的AChE活性来减轻胆碱能损伤。Hira等[69]发现β-胡萝卜素(41)能够增强链脲佐菌素诱导的SD小鼠的认知能力,其可通过降低氧化应激水平减少小鼠脑内Aβ沉积。分子对接实验揭示β-胡萝卜素与AChE具有强的结合力,可通过抑制AChE活性防止ACh浓度降低。

2.4 多靶向抗AD活性成分

Chowdhury等[70]发现小豆蔻中的单萜类化合物α-乙酸松油酯(42)对ChE具有良好的抑制活性,也可降低Aβ诱导的神经毒性、减少过氧化氢诱导的氧化应激。电子药代动力学表明该活性成分符合Lipinski法则,能到达AD患者大脑中的分子靶点。Plazas等[71]从花椒根提取物中分离得到的异喹啉类生物碱两面针碱(43)和Avicine(44)为ChE、MAO-A和Aβ1-42的多靶点抑制剂。其中avicine的抑制能力较强,对AChE和BChE的IC50值分别为0.511和0.123 μmol/L。它们还具有中等强度的Aβ1-42抗聚集活性和MAO-A抑制作用,IC50值在0.5和2 μmol/L之间。Tang等[72]从4207种天然化合物中筛选出具有抗炎特性以及良好的血脑屏障渗透性能的倍半萜内酯1,6-O,O-diacetylbritannilactone(45)。该活性成分能通过抑制BACE1的表达和tau蛋白磷酸化,减少AD小鼠脑内的Aβ斑块沉积;还可抑制炎性细胞因子的表达、增加谷胱甘肽、降低丙二醛和超氧化物歧化酶的水平,减轻小胶质细胞和星形胶质细胞的过度激活。

近年来,人参皂苷治疗AD的作用机制也得到广泛研究,证实多种人参皂苷单体化合物可通过多靶点、多途径治疗AD[73,74]。其中,人参皂苷Rg1(46)可增强突触神经可塑性并调节神经递质传递[75],抑制神经元细胞凋亡[76],对ChE和BACE1均有抑制作用[77],还可下调NADPH氧化酶2活性以减少Aβ沉积[78],且具抗氧化应激作用[79],极具开发为更有效治疗AD的药物的潜力。Cui等[80,81]通过体内外实验证明了人参皂苷Rg2(47)可通过调控PI3K/Akt信号通路发挥其抗Aβ毒性、抗细胞凋亡和抗氧化应激等作用。Ke等[82]研究发现人参皂苷Rb1(48)可作为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)的激动剂,降低Aβ25-35作用的PC12细胞的胆固醇水平,减少活性氧的生成和脂质过氧化,从而抑制Aβ毒性、保护神经细胞。人参皂苷Rd(49)和Re(50)都能促进胆碱能传递[83],Rd还可通过抑制GSK3β和CDK5的表达降低tau过度磷酸化[84],Re则可通过调控Nrf2/HO-1和ASK1/JNK/BAX通路抑制Aβ25-35诱导的氧化应激和细胞线粒体功能障碍,发挥神经保护作用[85]。

3 总结与展望

天然产物类型多样,药理活性广泛,一直以来是新药研发的重要源头[86,87]。而当前AD候选药物临床试验的高失败率警示我们需要在抗AD潜在的活性成分筛选方面不畏艰辛、迎难而上。分析当前状况,天然抗AD活性成分的筛选到临床应用仍存在一些问题。首先,随着发现的活性成分种类数量指数级增加,传统的高通量筛选方法已难以满足新药开发的需求。近年来分子相似性方法、机器学习和深度学习等人工智能化的新型虚拟筛选技术凭借其高效率和低成本的显著优势,为天然产物先导化合物的发现提供了新的途径。因此,采用虚拟筛选技术和实验验证相结合的方式,将会加速天然产物作为抗AD药物新化学骨架或活性前体的发现周期。其次,当前的AD动物模型并不能完全模拟AD的所有病理特征。需要更好地理解各个模型的特点与局限性,使用多种模型综合评估天然产物的AD治疗效果,明确其作用靶点和分子作用机制[88]。再次,一些天然抗AD活性成分存在生物利用度低、难以透过血脑屏障等问题,需进一步结构修饰和优化,或采用剂型改造和联合用药等方法,提高对靶点的选择性与抗AD疗效。最后,除了植物来源性天然产物,海洋来源和真菌来源的天然产物也为抗AD药物研发提供了新的来源。

相信随着医药学界对AD病机的不断探究,现代分析技术、靶向筛选方法、计算机辅助药物设计和人工智能技术等的不断发展和进步,从天然产物中开发抗AD药物定会取得重大进展。