脑脊液二代测序在结核性脑膜炎中的临床研究

张小丽 陈梅 李明峡 韩本发

摘要：目的 观察结核性脑膜炎的临床诊断中脑脊液二代测序技术在早期诊断中的应用价值。方法选取2019年2月～2019年8月我院胸科收治的12名怀疑患有结核性脑膜炎的患者，以跟踪随访的方式对其最终的诊断结局进行了解，并且同时将脑积液标本用二代测序技术实施检测。对比检测结果与病原数据库，分析结果的实际情况。在对比中，二代测序结果的判定标准为检测到结核分枝杆菌复合群唯一对比序列，并且显示阳性。未检测到的唯一对比序列则认定为阴性。将符合脑脊液结合分支杆菌的具体样本进行培养，涂片阳性以及检测阳性四项指标的对比检验中至少有一项符合阳性标准，即可判定为患有结核性脑膜炎。在临床上，若怀疑患有结核性脑膜炎，并且在同步应用抗结核治疗方法后有效果的患者可以纳入临床诊断患者范围内，若其他病原学依据或临床检测结果能排除结核性脑膜炎患病，则可判定为非结核性脑膜炎患者。以上述判定依据为基础，分析二代测序技术在结合性脑膜炎早期诊断中的敏感性水平和特异程度。结果 不同检测方法在不同诊断标准背景下的诊断特异度均达到100%，传统方法和X-pert、二代测序技术在实践应用中显示出的敏感性差异程度较高，前两种检测方法与二代测序技术检测方法的敏感性具有显著统计学差异（P＜0.05）。结论 二代测序技术能够快速有效地检测出脑脊液中的结核分支杆菌复合群，敏感性和特异程度都相对更高，可应用于结核性脑膜炎的早期诊断中。

关键词：脑脊液二代测序技术；结核性脑膜炎；早期诊断

结核性脑膜炎主要的感染诱因是结核分枝杆菌，这种细菌会对人的中枢神经系统造成直接影响。随着感染频率的提高，现阶段结核性脑膜炎的发病率也呈现出逐步提高的趋势。由于脑膜炎疾病治疗的难度相对较大，治疗时间成本也相对更高[1～2]。如何在早期针对这类疾病进行有效诊断并给予针对性治疗，是降低治疗成本、提高治疗有效性的重要条件。

二代测序技术是从序列病原微生物的鉴定角度出发，发挥作用的创新技术，在实践应用中能够基于人体中枢神经感染细菌的情况进行初步诊断[3～4]。本研究选取疑似结核性脑膜炎的患者12例为研究对象，通过临床诊断以及二代测序技术预测诊断对比，明确该技术在结核性脑膜炎治疗过程中的应用价值。

1研究对象与方法

1.1 研究對象

采用前瞻性研究，结合患者入院治疗时间，选择固定时间区间的12例疑似结核性脑膜炎患者为研究对象，患者最大年龄65岁，最小年龄28岁，平均年龄（39.22±5.17）岁；男8例，女4例。所有参与研究的患者均要进行前期生命体征、病史评估，同时了解其疾病症状，给予初步检查。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：年龄＞18岁；临床诊断初步怀疑患有结核性脑膜炎，患者已出现结核性脑膜炎的典型临床症状，且生命体征其出现波动，具体表现为体温升高，头部剧烈疼痛，部分患者还出现呕吐和脑膜刺激现象[5]；将所有脑脊液样本送至专门研究所的二代测序平台进行检测，确保样本符合此检测技术应用的客观要求，脑脊液总量不得低于2 mL；所有患者均知晓本研究并签署同意书。

排除标准：确认感染其他病菌，而非结核性脑膜炎病菌的患者；送检样本总量低于2 mL的患者；合并其他类型的免疫系统或肿瘤类疾病的患者；由于个人原因在本研究期间主动退出的患者。

1.3 诊断主要依据

确诊患有结核性脑膜炎的诊断依据为脑脊液的结合分支杆菌培养或图片结果均显示为阳性，并且应用专业的 Xpert检测方法显示阳性，结核分支杆菌的核酸检测结果四项中也有一项呈现阳性。临床诊断依据方面，排除了感染其他病原体或肿瘤以及免疫性疾病，但患者在疾病治疗的过程中应用治疗结核性脑膜炎的药物显示治疗有效。

排除结核性脑膜炎患者的依据：一是患者明确判定为其他感染，而非结核分支杆菌感染，具体的感染病菌包括布鲁杆菌，隐球菌或其他病毒；二是患者若符合肿瘤疾病或自身免疫性疾病等一系列未感染此类疾病的诊断结果，则可判定其未患上结核性脑膜炎。

1.4 检测方法

本研究的检测工作均送检专门的检测平台，观察符合率指标。检测到分支杆菌复合群的唯一对比序列，则可判定为阳性，未检测到判定为阴性。及时排除背景序列的影响，分析检测结果时，唯一对比序列最少1条，最高180条以上，平均序列数达到18条左右。

1.4 统计学方法

数据处理采用SPSS 22.0统计学软件，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 观察队列标本和诊断结果的符合情况

确诊患者10例，应用常规Xpert检测方法检测到的确诊患者6例，培养后阳性患者3例。结核分枝杆菌检测确诊患者6例，临床诊断患者8例。

2.2 二代测序技术和传统诊断技术检测结核分支杆菌的效能分析

诊断结果：分支杆菌培养阳性和核酸阳性患者6例，应用二代测序技术检测阳性，传统检测技术检测阴性患者6例。在12例确诊患者中，经过二代测序技术诊断确诊的患者10例，诊断敏感度83.3%。较之传统检测方法，二代测序技术在检测敏感度相对更高（P＜0.05）。见表1。

2.3 二代测序方法与Xpert方法的敏感度和特异度比较

两种检测方法的敏感度和特异度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3讨论

结核病属于细菌感染类疾病，患者在患病后由于细菌感染，会出现生命体征异常或慢性传染性疾病。相关研究结果显示，因结核病而死亡的病例在占比方面呈现出逐步提升的状态，脑脊液结核也属于由于细菌直接侵犯人的脑细胞造成的一种疾病，是除了肺结核外严重程度相对更高的一种疾病类型，病残率和病死率较高。临床需坚持早发现、早治疗的防治原则[6]，避免患者疾病恶化，危及其生命。临床诊断与专业技术诊断方法都可用于此类疾病的诊断，且专业技术诊断方法所应用的设备也在实际中存在差异，这也是这类疾病诊断存在客观困难的主要原因。在长期的诊断工作总结中，难治性结核脑膜炎的患者呈现出不断增加的发展趋势，这也给早期诊断工作带来了新的挑战，结核病之所以会发展到难治的状态，主要由于患者在患病初期未能及时得到诊断，患者患病后自身对于疾病的敏感性以及对一些真正的敏感性也存在不足，导致患病后未能及时就诊和确诊。

从目前的实际情况出发分析可知，目前诊断结核性脑膜炎的金标准集中在应用脑脊液检测达到疾病判断。诊断脑脊液的过程中，需要精确判定结核分支杆菌的具体感染情况。但从实际出发来讲，脑脊液涂片在染色时，由于其抗酸特征，染色直接可判定阳性的概率相对较低，只能达到10%左右。由此可见，直接检测脑脊液并参照图片进行疾病诊断，在准确率方面会受到一定的影响。但现阶段针对这类结核病的诊断也出现了一些新型的技术，如分子诊断技术、二代测序技术都能够从实际出发提升疾病诊断的有效率，为疾病诊断提供了非常重要的技术支持。

二代测序技术的主要特征在于高通量。测序技术常见应用在糖尿病、肿瘤疾病以及产妇的产前诊断过程中。随着该技术在各个疾病诊断的过程中得到应用，目前在针对脑脊液诊断时也开始应用该技术，主要通过对病原体进行检测，判断患者是否能够确诊疾病。据相关数据报道信息显示，此种技术在临床应用时，需要纳入多方面评价指标，且评价工作的全面性精准性也要达到一定程度。二代测序技术是此类技术中非常典型的技术类型，不仅能够保证检测效果的通量，也能够确保检测结果准确性达到更高的水平，在临床诊断中占据非常重要的地位。另外，该技术作为一种分子诊断技术，在细菌、真菌和病毒的诊断中也能发挥一定的作用，这对传染性疾病的诊断来说有非常重要的意义。本研究结果显示，不同检测方法在不同诊断标准背景下的诊断特异度均达到100%，传统方法和X-pert、二代测序技术在实践应用中显示出的敏感性差异程度较高，前两种检测方法与二代测序技术检测方法的敏感性比较具有显著统计学差异（P＜0.05）。由此可见，该技术在早期诊断检测中具有非常显著的应用价值。

二代测序技术对病原体具有非常显著的检测应用效果。同时，对未知病原体也能够发挥一定的检测作用。在此种技术应用时，可实施全基因组测序分析，这一分析过程能够直接将细菌培养结果中具有相似度且不好区分的相关病原进行精准辨认。同时，能够保证对阳性患者具备敏感性较高的检测状态。从检测速度上来讲，二代测序技术比传统检测技术在检测工作落实的用时上相对更短。因此，在同等检测结果的背景下，二代测序技术的应用效率也会更高。但从实际出发来讲，此种技术在应用中也会遇到一些现实问题，主要表现在以下幾方面：一是在标本制备环节容易受到外部环境条件的限制。应用二代测序技术虽然能够直接检测出DNA的类型，并且确认病原体的具体情况，但对RNA类型的病原体还未能做到同步取得预期的检测效果。二是目前此类技术的检测费用相对较高，这与检测技术未能全面普及有直接的关系。在实际应用中，此种技术的应用也会受到一定的限制，不能直接用于检测结核性脑膜炎的病菌。应用前，需要判断患者是否具有耐药性，若一部分患者具有耐药性，则患病后初步诊断时无法得到预期的良好效果。

综上所述，应用二代测序技术进行结核性脑膜炎的诊断检测具有检测效果和检测敏感度均较高的特征，在这类疾病的早期诊断中有非常显著的应用价值。但进行诊断价值评估时，应分别从临床诊断和确诊患者的实际情况两方面入手进行诊断判断，提高诊断结果预判的可靠性。

参考文献

[1] 张丽华，罗松，许书添，等.两次脑脊液宏基因二代测序诊断系统性红斑狼疮并发进行性多灶性白质脑病[J].肾脏病与透析肾移植杂志，2022，31（6）：595-600.

[2] 张金莉.脑脊液二代测序诊断成人皮疹阴性水痘-带状疱疹病毒脑炎1例[J].实用医技杂志，2022，29（10）：1119-1120.

[3] 何思科，卫静雯，冯家鸣，等.脑脊液宏基因组二代测序辅助诊断艾滋病合并弓形虫脑炎一例[J].华西医学，2022，37（8）：1268-1270.

[4] 谢馨，张明杰，范进，等.头颅影像结合脑脊液二代测序诊断咽峡炎链球菌群致硬膜下积脓一例[J].华西医学，2022，37（8）：1261-1263.

[5] 张绵，曾东，郑华.宏基因组二代测序对重症监护病房内脓毒症患者治疗及预后的影响研究[J].黑龙江医学，2022，46（9）：1032-1034.

[6] 罗智强，廖建湘.儿童广州管圆线虫脑膜炎3例临床特点及脑脊液宏基因二代测序诊断价值分析[J].中国实用儿科杂志，2022，37（1）：59-62.