戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片对卵巢早衰小鼠激素水平和肠道菌群的调节作用

闫丽，王恺悦，王喜良，于月新

（北部战区总医院生殖医学科，沈阳 110016）

卵巢早衰 （premature ovarian failure，POF） 是指女性40岁前出现卵巢功能减退，出现闭经、促性腺激素过高和雌激素缺乏现象，是一种常见的妇科内分泌疾病，严重影响患者身体健康［1］。POF的诱发因素主要有遗传、免疫、医源性、环境、心理等因素［2］。目前，激素替代疗法是治疗POF的最常用方法，通过服用激素模拟人体激素分泌，可以改善POF症状［3］。近年来研究［4］发现，肠道菌群与多种疾病密切相关，如精神分裂症、帕金森病、肥胖和代谢性疾病等。其中，肠道菌群与生殖系统疾病的发生、发展关系密切。动物研究［5］结果显示，高脂饲料喂养的成年雄性小鼠中，肠道菌群影响精液微生物群的产生，进而影响精液的质量。在多囊卵巢综合征患者中，肠道菌群组成紊乱，药物治疗后肠道菌群的多样性和丰度明显改善［6］。但是，肠道菌群与POF的相关性尚未见研究报道。

本课题组前期研究建立了POF小鼠模型，并分析了其肠道菌群的变化，结果显示，POF小鼠肠道菌群组成的多样性及个别种属菌群的丰度发生显著改变。为进一步探究肠道菌群与POF的相关性，本研究采用最常用的激素替代疗法 （戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片） 对POF小鼠模型进行干预，分析肠道差异菌群，探究此治疗方案对肠道菌群紊乱的回调作用，旨在从肠道微生态层面探究戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片的作用机制，为临床探讨POF的发病机制和药物治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雌性C57BL/6小鼠24只，8周龄，由辽宁长生生物公司提供［SCXK （辽） 2020-0001］。保持室温在20～24 ℃，饲养于北部战区总医院实验动物部［SYXK （辽） 2018-0021］，给予全价营养饲料，自由饮水和进食。

1.1.2 主要试剂和设备：戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片 （拜耳医药保健有限公司广州分公司），环磷酰胺 （德国Baxter Oncology GmbH公司），水合氯醛（北纳生物有限公司），雌二醇酶联免疫检测试剂盒、促卵泡生成素酶联免疫检测试剂盒 （上海江莱生物），BY-600A型离心机 （北京白洋医疗器械有限公司），BX51显微镜 （日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 POF小鼠模型的建立和分组：将C57BL/6雌鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组8只。对照组不作任何处理。模型组和治疗组建立POF模型，小鼠腹腔注射环磷酰胺 （50 mg·kg-1·d-1） ，连续注射15 d。卵泡刺激素 （follicle-stimulating hormone，FSH） 升高，雌二醇 （estradiol，E2） 水平降低，各级卵泡显著减少，表明POF模型构建成功。造模结束7 d后，治疗组小鼠给予戊醇雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片灌胃处理，5 d为1个周期，共3个周期。将戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片溶于ddH2O，灌胃第1～2天，给予戊酸雌二醇0.13 mg·kg-1·d-1，第3～4天，给予戊酸雌二醇0.13 mg·kg-1·d-1，雌二醇环丙孕酮0.065 mg·kg-1·d-1，第5天不做处理。

1.2.2 小鼠一般状况观察：造模和治疗过程中，观察小鼠精神状态、活动情况、毛发光泽度和进食情况，记录体质量变化。

1.2.3 动物取材和处理：小鼠10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉，摘眼球采血。小鼠处死后，取双侧卵巢置于中性福尔马林中固定。取小鼠结肠端粪便，保存于无菌冻存管，-80 ℃保存。

1.2.4 血清激素水平检测：采用ELISA法检测血清FSH、E2的水平，按照试剂盒说明书操作。

1.2.5 卵巢形态学观察：小鼠卵巢经固定后进行石蜡包埋，切成5 μm的切片，HE染色后观察卵巢形态，统计各级卵泡数量。

1.2.6 肠道菌群多样性分析：每组随机选取5个粪便样本送至上海伟寰生物公司进行肠道菌群多样性检测。提取样本总DNA，对细菌16S rRNA基因的V3～V4可变区进行PCR扩增。引物序列：341F，5’-ATGCGTAGCCGACCTGAGA-3’；805R，5’-CGTC AGACTTTCGTCCATTGC-3’。构建Miseq文库，应用Illumina NovaSeq PE250平台进行高通量测序，得到序列信息，处理后形成扩增子序列变异 （amplicon sequence variant，ASV），对其进行聚类、注释和一系列综合性分析，其中厚壁菌门与拟杆菌门的相对丰度含量比值 （F/B） 是一个能反映机体健康或炎症状态的指标，F/B越低，机体越健康，F/B越高，炎症反应越严重。

1.2.6.1 α多样性分析 使用Shannon指数反映样本的微生物α多样性。Shannon指数越大，样本中微生物种类越丰富，多样性水平越高。

1.2.6.2 β多样性分析 β多样性主要反映组间差异，使用ANOSIM分析检验组间差异是否显著大于组内差异，采用主坐标 （principal co-ordinates analysis，PCoA） 分析、非度量多维尺度法 （non-metric multidimensional scaling，NMDS） 分析反映微生物群落的相似性。每个点代表1个样本，相同颜色为1组，点之间的距离越近，相似度越高。

表1 小鼠体质量的比较Tab.1 Comparison of body mass in mice

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料用表示，采用t检验进行比较。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况比较

对照组小鼠精神状态好，毛发光滑，反应灵敏。模型组小鼠精神萎靡，活动性差，出现一定程度的脱毛，身形消瘦。治疗组小鼠进食量增加，毛发稍有光泽，反应较为敏捷，体质量较模型组增加。

2.2 小鼠体质量比较

实验前 （Day 0），3组小鼠比较，体质量无统计学差异 （P> 0.05）。腹腔注射环磷酰胺15 d后 （Day 15），与对照组比较，模型组和治疗组小鼠体质量明显降低 （P< 0.05）。经戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片灌胃治疗15 d 后 （Day 37），与对照组比较，模型组小鼠体质量明显降低 （P< 0.05）；与模型组比较，治疗组小鼠体质量明显升高 （P< 0.05）。见表1。

2.3 小鼠血清激素水平比较

与对照组比较，模型组FSH水平明显升高，E2水平明显降低 （P< 0.05）；与模型组比较，治疗组FSH水平明显降低，E2水平明显升高 （P< 0.05）。见表2。

表2 小鼠血清激素水平和卵泡数量的比较Tab.2 Comparison of serum hormone levels and follicle number in mice

2.4 小鼠卵巢卵泡数量比较

与对照组比较，模型组小鼠卵巢发育卵泡、成熟卵泡明显减少，闭锁卵泡明显增加 （P< 0.05）；与模型组比较，治疗组发育卵泡明显增加，闭锁卵泡明显减少 （P< 0.05），成熟卵泡数量无明显变化 （P>0.05）。见表2。

2.5 各组小鼠肠道菌群多样性比较

2.5.1 肠道菌群测序分析：对每组小鼠的5个粪便样本进行16S rRNA测序，得到ASV信息。共获得1 040个ASV，其中对照组555个，特有的ASV 212个；模型组455个，特有的ASV 181个；治疗组611个，特有的ASV 240个。3组共有的ASV 176个。见图1。

图1 小鼠肠道菌群ASV韦恩图Fig.1 Venn diagram of ASV of the intestinal flora in mice

2.5.2 α多样性分析：本研究中，各样本的Goodscoverage指数接近于1，表明测序深度已基本覆盖到样本所有的物种 （图2A）。随着样本序列数的增加，曲线逐渐趋于平坦，表明测序数据量足够反映样本中绝大部分的序列信息，结果可信度高 （图2B）。对照组、模型组、治疗组的Shannon指数分别为4.60±0.232、5.60±0.426、5.78±0.381。结果表明，与对照组比较，模型组和治疗组小鼠肠道中微生物种类多样性增加 （P< 0.05）。

图2 小鼠肠道菌群的α多样性分析Fig.2 α diversity analysis of intestinal flora in mice

2.5.3 β多样性分析：ANOSIM分析结果为R= 0.671，P= 0.001，表明3组间物种丰富度有显著差异 （图3A）。肠道菌群PCoA分析和NMDS分析反映组间微生物群落的差异程度。结果显示，对照组与模型组菌群明显分开，表明2组菌群结构有显著差异；治疗组位于2组之间，表明戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片灌胃治疗对小鼠肠道菌群结构差异有回调作用 （图3B、3C、3D）。

图3 小鼠肠道菌群的β多样性分析Fig.3 β diversity analysis of intestinal flora in mice

2.5.4 物种组成丰度分析：采用柱形累加图 （图4）表示3组小鼠粪便中的肠道菌群在不同分类水平上物种的相对丰度。与对照组比较，模型组F/B明显升高，Muribaculaceae丰度明显降低，Lachnospiraceae、Alistipes丰度明显升高 （均P< 0.05）；与模型组比较，治疗组F/B明显降低，Muribaculaceae丰度明显升高，Lachnospiraceae、Alistipes丰度明显降低 （均P<0.05）。见表3。

图4 小鼠肠道菌群的相对丰度Fig.4 Relative abundance of intestinal flora in mice

表3 小鼠肠道菌群丰度比较Tab.3 Comparison of abundance of intestinal flora in mice

3 讨论

肠道菌群与人类健康密切相关，是肠道的重要组成部分，在多种疾病的发生、发展中扮演重要角色，或可作为综合防治策略之一。本研究建立环磷酰胺诱导的POF模型，并给予戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片治疗，探究其对小鼠激素水平和肠道菌群的调节作用，通过分析肠道菌群的变化，从肠道菌群的角度为治疗POF提供科学依据。

卵巢内分泌水平能够间接反映卵巢功能。通过下丘脑-垂体-性腺轴调控各种激素的分泌，下丘脑通过分泌促性腺激素释放激素 （gonadotropin releasing hormone，GnRH） 作用于垂体；垂体释放FSH，正反馈作用于卵巢，刺激分泌E2；E2过高时会通过负反馈调节GnRH和FSH的水平，维持机体激素的动态平衡［7］。E2和FSH 可作为评价卵巢功能的重要指标。E2是成熟卵泡分泌的一种雌激素，能够促进颗粒细胞增殖、分化，调控颗粒细胞的凋亡，调节类固醇激素水平。FSH主要起到促进卵泡颗粒细胞分化成熟、控制卵泡发育的作用，FSH激素水平较高时，会造成卵泡早熟和提前排出，导致卵泡衰竭。当E2分泌水平过低且FSH分泌水平过高时，可初步评估卵巢的储备功能，对判断POF有重要作用［8］。本研究中，与对照组比较，模型组小鼠血清E2水平显著降低，FSH水平显著升高，体质量降低，卵巢中发育卵泡、成熟卵泡减少，闭锁卵泡增加，表明环磷酰胺会对下丘脑-垂体-性腺轴产生干扰，影响小鼠生长和发育，降低卵巢储备功能。与模型组比较，治疗组E2水平显著升高，FSH水平显著降低，体质量增加，发育卵泡增加，闭锁卵泡减少，表明戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片能够改善小鼠的激素紊乱和卵巢功能衰退。

血液中激素水平也与肠道菌群有关，菌群组成紊乱影响小鼠的肠肝循环，使代谢产物β-葡萄糖醛酸酶影响结合雌激素与游离雌激素二者的转换过程，从而影响血清中雌激素的水平［9］。肠道菌群一般处于动态平衡中，与宿主相互作用，通过调节糖、脂质和氨基酸等物质的代谢，影响疾病的发生、发展，菌群失调将会导致相关疾病的发生，如肠炎、阿尔茨海默病、肥胖等［10-11］。本研究采用16S rRNA测序技术分析小鼠肠道菌群的变化，与模型组相比，治疗组F/B降低，表明小鼠肠道炎症反应有所缓解。与模型组比较，治疗组优势菌群Muribaculaceae的丰度恢复。Muribaculaceae作为有益菌，与纤维降解有关，可产生琥珀酸、乙酸和丙酸，与维持肠道稳态和改善炎症性疾病有关［12］。与模型组比较，治疗组Lachnospiraceae的丰度降低。Lachnospiraceae与代谢紊乱、糖尿病的发生有关，其丰度与葡萄糖或脂代谢呈正相关，丰度越高，炎症反应越严重［13］。以上结果表明，戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片能够改善POF小鼠肠道的炎症反应，在维持肠道稳态上发挥重要作用。与模型组比较，治疗组Alistipes丰度降低。在致病性方面，Alistipes与抑郁症、焦虑症、结肠癌有关，Alistipes的增加可能通过破坏肠-脑轴来减少血清素的可利用性，引发抑郁症［14］。本研究中，模型组小鼠精神萎靡可能与该菌群丰度增加有关。

综上所述，本研究结果表明，戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片能够缓解小鼠的激素紊乱和卵巢功能衰退，减轻POF小鼠的肠道炎症反应，改变肠道黏膜的通透性，增加有益菌Muribaculaceae的丰度，减少有害菌Lachnospiraceae、Alistipes的定植，对小鼠肠道菌群紊乱有一定的改善作用。本研究从肠道微生态层面上探究了戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片治疗POF的作用机制，为临床探讨POF的发病机制和药物治疗提供了理论依据。