IL-9 及其受体通过STAT3 通路激活巨噬细胞促进慢性阻塞性肺疾病进展

高媛，周新佳，周妍，赵立

（中国医科大学附属盛京医院 1. 呼吸与危重症科； 2. 耳鼻咽喉头颈外科，沈阳 110004）

慢性阻塞性肺疾病 （chronic obstructive pulmonary disease，COPD） 是一种常见的慢性气道炎症疾病，严重危害人类身体健康［1］。研究［2］表明，免疫失衡在COPD中起重要作用。作为免疫调节的中心环节，辅助T细胞及其产生的细胞因子参与黏膜炎症的各种免疫反应［3-4］。白细胞介素-9 （interlukin-9，IL-9） 是一种多功能细胞因子，主要由活化的Th9细胞分泌。 IL-9与IL-9受体 （IL-9 receptor，IL-9R） 结合后，激活STAT3通路，启动一系列基因表达，发挥相应的生物学作用［5］。既往研究［6］表明，COPD患者肺组织中IL-9的表达上调。此外，也有研究［7］表明IL-9促进COPD疾病进展，具体机制可能与氧化应激有关。

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，通过抗原呈递参与炎症反应的发生、发展，是COPD免疫致病机制的关键环节［8-9］。 巨噬细胞具有高度可塑性，当受到微环境的刺激时，其表型和功能会发生适应性变化［10］。 香烟烟雾可诱导巨噬细胞活化并增加数量。 活化的巨噬细胞释放趋化因子和基质金属酶，促进炎症并破坏肺微环境［11］。JAK/STAT3是COPD发生发展的重要信号通路之一。 它参与多种细胞因子的信号转导，影响T细胞的分化。有研究［12］表明，IL-9与IL-9R结合可以激活巨噬细胞。目前，IL-9在COPD发展中的调控机制尚未阐明，IL-9在COPD病程中对巨噬细胞功能的影响亦不清楚。本研究通过构建香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型，探讨 IL-9及IL-9R在COPD进展中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料及实验动物

红双喜香烟 （烟尼古丁含量1.2 mg/支，焦油含量15 mg/支） 购自上海卷烟厂。IL-9多克隆抗体 （bs-2428R）、P-STAT3抗体 （bs-1658R） 和基质金属蛋白酶12 （matrix metalloproteinase，MMP12） 抗体 （bs-1854R） 购自北京Bioss公司。 IL-9R 抗体 （ab233757） 购自英国Abcam公司，STAT3 抗体 （#12640S）、GAPDH （#5174S） 购自美国CST公司，p-STAT3 （sc-8059P） 购自美国Santa Cruz 公司。白细胞介素-6 （interleukin-6，IL6） 检测试剂盒 （SEA079Hu） 购自美国USCN公司，肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 检测试剂盒 （SEA133Hu） 购自美国USCN公司，MMP-12检测试剂盒 （SEA402Hu） 购自美国USCN公司。AG490（CSGC13854） 购自武汉科斯坦生物科技公司。小鼠肺泡巨噬细胞 （MH-S） 购自上海酶研生物科技有限公司。24只雄性C57BL/6小鼠 （8周龄，体质量20～25 g） 购自辽宁长生生物技术公司。

1.2 实验分组及香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型建立

小鼠在 （22±2） ℃、相对湿度 （55±15） %、光照12 h/黑暗12 h的清洁环境中饲养。应用随机数字表将24只小鼠均分为3组：吸烟组［CS组，每天放置在舱内，建立香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型 （香烟暴露：10支/次，2次/d，60 min/次，5 d/周，连续暴露6个月） ］、戒烟组［cession-CS组，小鼠每天置于舱内，连续香烟暴露 （10支/次，2次/d，60 min/次，5 d/周） 6个月，停止烟雾暴露6个月］、对照组 （小鼠暴露于过滤空气中，除香烟暴露外，其他条件与吸烟组相同，连续暴露6个月）。3组均在实验后 24 h内腹腔麻醉小鼠 （10%水合氯醛溶液，0.3 mL/100 g），通过眶后动脉放血处死。取出左肺，10%甲醛灌注左肺下叶，使之膨胀后再用10%甲醛固定48 h后石蜡包埋保存备用。右肺组织迅速移至-80 ℃冰箱保存备用。本研究经中国医科大学盛京医院动物伦理委员会批准 （批准文号：2016PS179K）。

小鼠肺泡巨噬细胞 （MH-S）给予不同浓度 （0、10、30 ng /mL） IL-9干预，干预 2、4、6、12 h时检测IL-6、TNF-α、MMP-12水平。进一步将小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S） 分为对照组、干预组 （加入30 ng /mL IL-9干预12 h）、AG490+IL-9干预组 （加入AG490、30 ng/mL IL-9干预12 h）。采用PCR及Western blotting检测STAT3、p-STAT3及MMP-12的表达情况。

1.3 方法

1.3.1 HE 染色：取石蜡包埋的肺组织，在距肺门 3 mm 处连续水平切片 （厚度3～4 μm）。乙醇和二甲苯脱蜡至水，苏木精浸渍，1%盐酸乙醇分化，0.5%伊红溶液复染，透明盖玻片脱水。每张切片在10 倍物镜下随机选取10 个非重复视野，在 100 倍物镜下采集图像，由2位病理医生读片，获得肺泡间隔 （linear intercept，Lm） 和肺泡破坏指数 （destructive index，DI）。Lm反映肺泡直径，具体测量方法：避开大血管和支气管，在视野的中心画十字，计算与十字相交的肺泡间隔数，测量十字的总长度，根据Lm=十字总长度/肺泡格数来计算。DI反映肺泡壁结构的破坏程度，具体测量方法：目镜内放置一个标有42个点的计数网格。如果视野中的标记点落在所见的肺泡腔或肺泡囊腔内，则记为肺泡正常 （normal alveolar and/or duct spaces，N） 或肺泡破坏 （destroyed alveolar and/or duct spaces，D）；如果标记点落在其他结构上则不记录。计算DI=D /（D + N） 。

1.3.2 免疫组织化学染色：取3组石蜡包埋肺组织，切片、脱蜡、水化后，抗原修复，用3%过氧化氢去除内源性氧化酶，山羊血清封闭，滴加一抗 （1 ∶400）、二抗PBS洗片孵育，DAB显色、复染、封片。各型炎症细胞以胞质和 （或） 胞膜呈棕黄色或棕褐色判定为阳性表达［13］。采用奥林巴斯光学显微镜 （40倍） 观察切片，通过Image-ProPlusV6.O图像软件分析3组阳性表达结果。

1.3.3 ELISA检测：小鼠肺泡巨噬细胞 （MH-S） 于37℃、5% CO2培养箱中培养，通过加入不同浓度 （0、10、30 ng /mL） IL-9干预MH-S细胞，在干预2、4、6、12 h后使用检测试剂盒检测TNF-α、IL-6和MMP-12的表达水平，操作均按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 实时定量PCR （real-time quantitative PCR，qRT-PCR）：使用Mini BEST Universal RNA Extraction Kit （9767，日本TaKaRa公司） 提取3组小鼠肺组织标本及肺泡巨噬细胞总RNA，并使用PrimeScriptTMRT Master MIX （RR036A，日本TaKaRa公司） 合成cDNA模板。使用紫外分光光度法测定 RNA 浓度和纯度。采用 One Step SYBR®PrimeScriptTMRT-PR KitⅡ（日本TaKaRa公司） 将 0.5 μg 总 RNA 逆转为 cDNA。使用 BIO-RAD （美国伯乐公司） 进行检测。引物序列：β-actin，正向5’-GCAGAAGGAGATTACTGCTCT-3’，反向5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’；IL-9，正向5’-CTGCTTGTGTCTCTCCGT-3’，反向5’-GACT TCAACTATCCTTTTCACC-3’；IL-9R，正向5’-GCTT TGTCCACCTTCTGTT-3’，反向5’-CACCATTCTGTCT TGCTTG-3’；MMP-12，正向5’-ATTTCCACACACTTCC CA-3’，反向5’-ACCCTTCACTACATTCTTCCT-3’；STAT3，正向5’-TCTACCTCTACCCCGACATT-3’，反向5’-ACTCAAACTGCCCTCCTG-3’。扩增产物长度为 135 bp。利用 2-ΔΔCt计算基因表达水平。

1.3.5 Western blotting检测：提取组织总蛋白，采用BCA法定量。 按每孔30 μg蛋白量进行电泳，将分离的蛋白转膜、封闭、加入一抗孵育。用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水洗涤膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗。 室温孵育1 h，洗膜后显色。采用江苏捷达801成像系统分析IL-9、IL-9R、STAT3、p-STAT3、MMP-12蛋白的吸光度。相对蛋白含量采用目标蛋白条带值/内参GAPDH条带值表示。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0进行统计分析，计量资料以表示。 多组间比较采用单因素方差分析。组间两两比较方差一致的采用 Bonferroni 检验，方差不一致的采用Dunnett’s T 3 检验。P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠气道炎症及肺泡损伤结果

HE 染色结果 （图1A） 显示，对照组小鼠肺泡结构完整，无明显炎症细胞浸润。 CS组小鼠支气管壁、血管壁、肺泡均有明显的炎性细胞浸润，杯状细胞有不同程度增殖。与对照组比较，CS组肺泡腔变大，肺泡间隔破裂。肺大泡融合，炎症细胞浸润明显。cession-CS组小鼠肺泡腔扩大，肺泡间隔破裂，炎症细胞浸润程度较CS组加重。进一步分析结果表明，CS组和cession-CS组Lm和DI均显著高于对照组 （P<0.001）。与CS组比较，cession-CS组Lm和DI显著升高（P< 0.05）。见图1B。表明香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型建立成功。香烟烟雾暴露对小鼠肺组织造成严重损害，并且戒烟后损害仍然加重。

图1 3组肺组织HE染色及病理形态学定量分析结果Fig.1 HE staining and histopathologic quantitative analysis of lung tissue in 3 groups

2.2 各组小鼠肺组织IL-9、IL-9R表达变化

免疫组织化学结果显示，IL-9和IL-9R 阳性细胞分布于肺泡壁、气道壁和巨噬细胞壁。 IL-9主要在浸润性炎症细胞中表达。CS组及cession-CS组肺泡壁和小气道IL-9和IL-9R阳性表达高于对照组 （均P<0.05）；而CS组IL-9和IL-9R阳性表达高于cession-CS组 （P< 0.05），见图2。

图2 免疫组织化学检测各组肺组织中IL-9和IL-9R阳性表达Fig.2 Positive expressions of IL-9 and IL-9R in lung tissues of each group determined using immunohistochemistry

2.3 各组小鼠肺组织IL-9、IL-9R、STAT3、p-STAT3、MMP-12表达

通过qRT-PCR及Western blotting检测小鼠肺组织IL-9、IL-9R、STAT3、p-STAT3、MMP-12表达的变化。结果显示，与对照组比较，CS组小鼠肺组织IL-9、IL-9R、STAT3和MMP-12表达显著升高 （均P< 0.01）。与CS组比较，cession-CS组IL-9、IL-9R、STAT3和MMP-12表达显著降低 （均P< 0.05），见图3A。 进一步Western blot-ting检测结果显示，与对照组比较，CS组小鼠肺组织IL-9、IL-9R、p-STAT3和MMP-12表达显著升高（P< 0.01）。与CS组比较，cession-CS组小鼠肺组织IL-9、IL-9R、p-STAT3及MMP-12水平降低 （P< 0.01），但仍显著高于对照组，见图3B。

图3 3组小鼠肺组织中IL-9、IL-9R、MMP-12、STAT3表达比较Fig.3 Comparison of IL-9，IL-9R，MMP-12，and STAT3 expressions in lung tissue of mice in 3 study groups

2.4 不同浓度 IL-9 对肺泡巨噬细胞炎症反应的影响

ELISA检测结果显示，与0 ng /mL IL-9比较，10、30 ng /mL IL-9干预2、4、6、12 h时肺泡巨噬细胞分泌IL-6、TNF-α和MMP-12水平逐渐增加 （P< 0.05）。与0 ng /mL IL-9比较，30 ng /mL IL-9干预12 h肺泡巨噬细胞分泌IL-6、TNF-α和MMP-12水平增加更明显 （均P< 0.000 1）。可见，随着IL-9浓度增加，肺泡巨噬细胞分泌 TNF-α、IL-6和MMP-12的水平也提高，见图4。

2.5 IL-9通过JAK/STAT3通路促进巨噬细胞活化

AG490可抑制JAK的激活，进而抑制下游因子p-STAT3水平。进一步将小鼠肺泡巨噬细胞分为对照组、IL-9 （30 ng /mL） 组、AG490+IL-9组，观察IL-9通过JAK/STAT3通路对MMP-12转录的影响。PCR结果显示，与对照组比较，IL-9组MMP-12表达上调，而AG490+IL-9组逆转了这种上调 （均P< 0.001）。Western blotting检测结果显示，与对照组比较，IL-9组MMP-12、p-STAT3表达升高，STAT3表达下降 （均P<0.05）；与IL-9组比较，AG490+ IL-9组MMP-12、p-STAT3表达下降，而STAT3表达升高 （均P< 0.05）。表明IL-9通过JAK/STAT3通路促进MMP-12的转录。见图5。

3 讨论

COPD是一种进行性慢性气道炎症疾病，临床表现为不完全可逆的气流受限和肺功能下降［14］。吸烟是发生COPD的主要危险因素。炎症反应是COPD的核心机制，主要影响小气道和肺实质，引起小气道阻塞［15］。戒烟后COPD炎症并不能完全消除，COPD患者戒烟后肺部炎症持续存在，并继续发展为肺气肿［16］。本研究构建了香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型。结果表明，戒烟后很长时间吸烟引起的损害仍然持续存在，与以往研究结果一致。

免疫调节在炎症的发展中起重要作用。多项研究表明，CD4+T细胞亚群 （包括Th1、Th2、Th17和调节性T细胞） 介导的免疫反应在COPD的发生发展中起重要作用。 Th9 细胞由 VELDHOEN 等［17］和 DARDALHON等［18］发现，是CD4+T淋巴细胞的一个新亚群。研究［19-20］显示Th9细胞及其分泌的细胞因子 IL-9参与免疫介导的疾病。哮喘或接触性皮炎患者外周血中Th9细胞明显增加，提示Th9细胞可能与过敏性疾病的发病有关。近期关于COPD的研究［5-6］表明，COPD患者诱导痰液中IL-9水平显著升高，提示IL-9参与了疾病进展。本研究免疫组化、Western blotting和PCR检测结果显示，香烟烟雾暴露诱导的COPD小鼠IL-9和下游信号通路激活。而戒烟后小鼠肺部IL-9和下游的STAT3/MMP-12通路仍处于过度激活状态。这些结果表明IL-9在COPD的疾病进展中起重要作用，在戒烟后也是持续气道重塑和肺气肿进展的重要因素。

IL-9R属于γ链细胞因子受体家族，由一条α链和一条γ链组成［21］。IL-9R在许多免疫细胞 （肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞） 中表达［22］。其中，巨噬细胞是连接先天免疫和适应性免疫的重要桥梁，是呼吸道和肺部抵御微生物感染的第一道防线。巨噬细胞活化在肺部疾病，尤其是COPD 中起着至关重要的作用。本研究结果显示，随着IL-9干预浓度的增加，小鼠肺泡巨噬细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-6和MMP-12分泌显著增加，表明IL-9通过受体IL-9R影响巨噬细胞炎症反应。研究［23］表明，IL-9与靶细胞表面的IL-9R结合后，激活JAK/STAT3通路，启动一系列炎性细胞因子转录，从而发挥生物学效应。本研究结果表明，Th9细胞分泌的IL-9 通过JAK/STAT3通路促进巨噬细胞活化，与以往研究结果一致。

综上所述，香烟烟雾诱导的 COPD 小鼠IL-9 及其下游信号通路激活；而戒烟后小鼠肺气肿持续加重，IL-9及其下游信号通路持续激活。IL-9 及IL-9R通过STAT3 通路激活巨噬细胞，促进COPD进展。本研究存在一定局限性：IL-9调控巨噬细胞功能的具体机制尚未明确；此外，缺乏临床病理标本的验证，因此仍需进一步研究论证。