基于急性肝损伤药效的丹参不同炮制品选择性研究

曹凤媚 严慧婕

（广州中医药大学第三附属医院药学部，广东 广州 510360）

丹参为一种常用的活血化瘀类中药，初载于《神农本草经》，其味苦，性微寒，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、养血安神和清心除烦等功效。现代药理研究［1-3］证实：丹参具有保肝、护心肌、抗血栓、保护血管内皮细胞、抗炎抗菌、抗肿瘤和抗氧化等一系列药理作用，临床上主要用于医治心血管系统疾病，近年来也用于肝损伤、痤疮、流行性脑膜炎和病毒性心肌炎等的治疗［4，5］。《中药炮制经验集成》中收载了生丹参、炒丹参、酒丹参、醋丹参和丹参炭等丹参的炮制品种类［6］，炮制方法不同，其中的化学成分含量也不同。但具体治疗不同病症时，应选择何种炮制品暂时还没有定论。

肝脏作为人体内主要的代谢器官，易受化学、药物、代谢、酒精及环境等多种因素的影响造成损伤。肝损伤是各种肝脏疾病的病变结果，长期的肝损伤易发展为肝纤维化、肝硬化、肝癌及肝功能衰竭，对身体健康造成严重的危害［7-9］。目前，对乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）作为大多数常用感冒药的主要成分，其大剂量或长期服用可造成脏器损伤，严重可致死亡。APAP是临床上引起肝损伤最常见的药物，其所致肝损伤模型为代表性的药物性肝损伤模型［10，11］。

丹参可防治多种肝病［12，13］，本研究拟以丹参不同炮制品对采用APAP 诱导的小鼠急性肝损伤模型的药效作为考察指标，以最直接的方式比较它们的药效差异，为丹参治疗肝损伤时选择合适的炮制品提供依据；同时也为其他中药材不同的炮制品在临床应用中的准确选择，探索更为合理的研究方法。

1 材料与试剂

1.1 材料主料：丹参（广州市岭南中药饮片有限公司佛山分公司，批号：1707001）；辅料：黄酒（上海金枫酒业股份有限公司，酒精度：14% vol）；老陈醋（山西水塔醋业股份有限公司，浓度：6 g/100 mL）。

1.2 仪器万分之一电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，BSl10S 型）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，KQ-300DE型，300 W，40 kHz）。

1.3 实验动物SPF 级昆明种小鼠，雄性，60 只，5 周龄，体质量（20±2）g，合格证号：SCXK（粤）2019-0047，购于广州中医药大学。

所有与动物相关的程序均符合广州中医药大学伦理委员会根据国家卫生研究所实验动物护理和使用指南批准的动物护理协议， 动物伦理批准号为44005900002835、44005900002836。

1.4 实验方法

1.4.1 丹参不同炮制品的制备

1.4.1.1 炒丹参的制备丹参文火炒至色泽为紫褐色，出现焦斑后取出放凉，即得炒丹参。

1.4.1.2 酒丹参的制备丹参用黄酒拌匀，闷透。置于锅内，文火炒干，取出放凉，即得酒制丹参［14，15］。每100 g丹参片用黄酒30 g。

1.4.1.3 醋丹参的制备丹参用醋拌匀，闷透。置于锅内，文火炒干，取出放凉，即得醋制丹参。每100 g丹参片用米醋30 g。

1.4.2 丹参不同炮制品浓缩液的制备取过8 号筛的生丹参、炒丹参、酒丹参及醋丹参药材细粉各100 g，加70%乙醇回流1 h，过滤，药渣再用8 倍量70%乙醇回流1 h，过滤，合并2 次滤液，回收乙醇，浓缩至1 g/mL 的稠浸膏，备用。

1.4.3 药效考察

1.4.3.1 实验动物分组取60 只SPF 级雄性昆明小鼠，依据随机数字表法分为6 组，即空白对照组、模型组、生丹参组、炒丹参组、酒丹参组和醋丹参组。除空白对照组外，其余各组小鼠一次性腹腔注射300 mg/kg 的APAP 溶液进行造模，6 h 后各组均灌胃给药，空白对照组和模型组给予生理盐水，其余各治疗组则给予相应炮制品的浓缩液，给药剂量均为2 mL/100 g，每天1次，连续给药10 d。

1.4.3.2 血液样品的采集及丙氨酸氨基转移酶（ALT）和门冬氨酸氨基转移酶（AST）的检测各组小鼠连续灌胃给药10 d，于第11 天摘眼球取血，室温静置20 min，离心提取血清，-80 ℃冰箱保存待测。检测时解冻，振摇混匀，严格按照试剂盒说明书操作步骤测定血清ALT 和AST水平。

1.4.3.3 肝脏组织中谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的含量测定取“1.4.3.2”项下的小鼠脱颈处死，解剖摘取肝脏组织，准确称取组织重量，按重量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例加入生理盐水，在冰水浴条件下用组织匀浆机机械匀浆，制备成10%的肝脏匀浆液，1690×g离心10 min，取上清液进行测定。

1.4.3.4 肝组织形态学变化取出小鼠肝组织，立刻浸入10%中性福尔马林液中进行固定，48 h 后用自来水冲洗固定液，用乙醇梯度脱水，透明化组织，浸蜡后包埋。制成4～5 μm 切片，经60 ℃烤片后采用常规的苏木精-伊红（HE）染色，观察［16-18］。

2 结果

2.1 各组对APAP 诱导的小鼠急性肝损伤模型血清ALT、AST 活性的影响与空白对照组比较，模型组小鼠血清ALT、AST 的水平均有显著性提高（P＜0.01），表明APAP 诱导的小鼠急性肝损伤模型复制成功；与模型组比较，4 个给药组可不同程度地降低小鼠血清中ALT、AST 的水平，降低幅度由大到小排列为醋丹参＞酒丹参＞生丹参＞炒丹参。

其中，醋丹参组、酒丹参组和生丹参组分别与模型组比较，ALT、AST 降低水平均显著优于空白对照组（P＜0.01），说明上述3 组给药组能减少由APAP 诱导的急性肝组织损伤。见表1。

表1 各组对APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型血清ALT、AST活性的影响（±s，ng/L）

表1 各组对APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型血清ALT、AST活性的影响（±s，ng/L）

注：与空白对照组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01。

组别空白对照组模型组生丹参组炒丹参组酒丹参组醋丹参组AST 90.94±3.80 123.21±5.511）106.18±7.042）110.13±9.55 100.07±6.542）98.69±6.222）鼠数10 10 10 10 10 10 ALT 40.82±2.10 61.77±3.951）49.18±5.352）55.78±4.56 47.09±4.392）45.60±3.872）

2.2 各组对APAP 诱导的小鼠急性肝损伤模型的肝组织病理结果空白对照组小鼠肝组织结构正常，肝小叶清晰，肝细胞排列规整、核形态正常；模型组小鼠经300 mg/kg 的APAP 诱导后，肝组织结构被破坏，肝小叶模糊，肝细胞被炎症细胞浸润，出现液化性坏死，呈溶解态并伴有出血。

与模型组比较，4 个给药组可不同程度地减轻小鼠肝组织的病变，使肝组织结构趋于正常。减轻幅度由大到小排列为醋丹参＞酒丹参＞生丹参＞炒丹参。表明4个给药组对APAP 引起的肝损伤有一定的保护作用。其中，醋丹参组、酒丹参组对肝损伤的保护作用较强，生丹参组对肝损伤保护作用较弱，炒丹参组的肝损伤保护作用最弱。见图1。

图1 丹参不同炮制品对小鼠肝组织病理形态的影响（HE，×10）

综上，丹参不同炮制品对小鼠急性肝损伤的治疗效果排序为醋丹参＞酒丹参＞生丹参＞炒丹参。故基于APAP 诱导的小鼠急性肝损伤药效结果可知，治疗肝损伤时准确选用丹参炮制品的顺序为醋丹参＞酒丹参＞生丹参＞炒丹参。

3 讨论

炮制系指将药材净制、切制和炮炙处理，制成一定规格的饮片，以适应医疗要求及调配、满足制剂的需要等，保证用药的安全和效用。其作为中药材前处理的关键步骤，不仅决定着药材的品质优劣，也影响着中药饮片有效成分的含量。药材通过不同的炮制，性味功能及药效可产生不同的变化，主要原因在于药材的有效成分与炮制所用的辅料之间发生的化学反应可影响有效成分的含量，从而增强药效、减少毒副作用［19，20］。

本实验研究发现，对小鼠急性肝损伤的治疗效果为醋丹参＞酒丹参＞生丹参＞炒丹参，原因可能在于：炒丹参在炮制的过程中需要加热升温，而丹参所含主要有效成分丹参酮ⅡA 和丹酚酸B 对热不稳定，故炒丹参中主要成分的损失较为严重，甚至比生丹参中的含量还要低；而醋丹参和酒丹参，尽管在炮制的过程中有效成分也有一定程度的损失，但其所加的辅料乙醇和醋对丹参主要有效成分有不同程度的保护作用，可增加其中有效成分的含量。其中，因为醋本身具有抗氧化等药效作用，故醋丹参治疗肝损伤的药效稍好于酒丹参［21-24］。

程立方等［25］采用正交实验考察了不同炮制方法对丹参酮ⅡA 的影响，结果显示丹参酮ⅡA 的含量依次为黄酒炙丹参（加酒量110%）＞黄酒炙丹参（加酒量60%）＞生丹参＞烘制丹参＞黄酒炙丹参（加酒量20%）＞麸炒丹参＞白酒炙丹参＞丹参炭，以黄酒炙丹参（加酒量110%）质量为最优，且丹参酮ⅡA 的含量与加酒量成正比；而李慧芬等［26］、陆小华［27］、李懿［28］和闫东晖［29］考察了不同的炮制方法对丹酚酸B 的影响，结果表明丹酚酸B 含量依次为酒丹参＞醋丹参＞生丹参＞炒丹参＞丹参炭。

但是，药材所含化学成分含量的高低与药效并不一定成正比关系，如李昌勤等［30］直接以药效为指标，采用纸片扩散法考察了丹参不同炮制品对金黄色葡萄球菌（SA）等病菌的抑制活性，结果表明炒丹参的抗菌活性最强，酒丹参的抗菌活性有所增强，而丹参炭具有一定抗菌活性但明显减弱。故尽管炮制后酒丹参中丹参酮ⅡA 和丹酚酸B 的含量最高，而炒丹参中含量较低，但就抗菌活性而言，炒丹参的抗菌药效最强，酒丹参仅有所增强。这可能是由于丹参中多种有效成分彼此间相互作用造成的，提示单纯从考察含量变化的角度来判断药效的好坏并不具有绝对代表性。

然而，目前众多的实验研究主要还是通过考察药材经过不同的炮制后主要成分的含量变化来判断药效的好坏，这种验证药效的方式相对片面。在临床用药的过程中，必须结合具体病症的治疗，进行不同炮制品与病症的匹配实验，才能进一步确定在治疗某特定病症时适合的炮制品类型。因此，相比于使用化学成分作为评判的指标，以其药效作为评判指标更为合理，更有利于提高临床效果。

因此，本实验选择以药效作为考察指标来筛选更为适合急性肝损伤治疗的丹参炮制品，以期为临床用药提供研究基础及相关依据。