抗恩拉霉素多克隆抗体的制备

叶健强，康润敏，余 华

（1.动物遗传育种四川省重点实验室，成都 610066；2.四川省畜牧科学研究院，成都 610066；3.四川出入境检验检疫局，成都 610041）

恩拉霉素（Enramycin，Er）又名恩霉素、安来霉素和持久霉素［1，2］，其主要成分是恩拉霉素A（C107H138N26O31C12R=CH3）和恩拉霉素B（C108H140N26O31C12R=C2H5OH），其结构式见图1。该药因具有很强的抗格兰氏阳性菌的作用，用作饲料添加剂能促进畜禽生长和提高饲料效率，与其他抗生素亦无交叉耐药，化学性能稳定，无致突、致畸、致癌作用，不易被吸收，残留极少，适口性好。中国于1988年农业部批准进口兽用恩拉霉素抗生素，但随着国内外养殖量的日益增加，饲养者为了追求产量，往往超量应用兽药、抗生素添加剂，造成动物性产品中有害化学残留物质日趋严重，这不仅加大了动物产品威胁人类健康的风险，也直接重创了中国动物产品出口贸易。因此，进出口动物性食品中该药物的残留问题备受关注，这就使建立恩拉霉素残留的快速测定方法并应用于畜禽产品的安全控制具有重要性和必要性。

图1 恩拉霉素（含A 和B）结构式

酶免疫测（EIA）中酶联免疫吸附测定法（ELISA）因较传统的微生物检测法、理化检测法具有简洁、快速、廉价、特异性强、灵敏度高等优点，已经被国内外广泛应用于兽药残留的检测中，但国内外鲜有有关恩拉霉素酶免疫检测技术报道［3-6］，检索到日本厚生省对畜、水产食品中有该项残留的常规检测技术报道［7］。为此，本试验旨在制备一种特异性的恩拉霉素多克隆抗体，为间接竞争性ELISA 快速检测恩拉霉素奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试验动物

1.1.1 试验材料 恩拉霉素［纯度≥98% ，由国家质检总局科技计划项目（2008IK013）课题组提纯］。戊二醛（成都金山化学试剂公司）、1，4-二氧六环（成都科龙化工试剂厂）、Na2HPO4·2H2O（天津博迪化工公司）、乙二胺四乙酸二钠（天津华兴精细化工公司）、NaH2PO4和碳酸钠（成都长聊化工试剂有限公司）、牛血清白蛋白（BSA，MW67000，上海博奥生物科技公司）、卵清蛋白（OVA，MW45000，上海基星生物科技公司）、弗氏完全佐剂（FCA）和弗氏不完全佐剂（FICA）（美国Sigma 公司）、透析袋（截留分子量14 000，美国Sigma公司），以上化学试剂均为分析纯。

1.1.2 试剂的配制与用品准备 取0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液72.0 mL、0.2 mol/L 磷酸二氢钠28.0 mL 于250 mL 三角瓶中，配成pH 7.2 的磷酸盐缓冲溶液（PBS）。用移液管吸取0.25 mL 戊二醛，将其配成100 mL 溶液，得0.25%的戊二醛溶液。

透析袋处理液，配制含碳酸钠10 g/L 及乙二胺四乙酸二钠（EDTA）1 mol/L 的碱性EDTA 溶液；1%琼脂糖配制，取15 g 琼脂糖加100 mL pH 7.1 磷酸盐缓冲液内，置水浴充分溶解，加入1 mL 1% 硫柳汞，待冷至45～50 ℃时，滴加到洁净载玻片上，待凝固放入带盖的瓷盘中备用。用孔径3.0 mm 打孔器在琼脂载玻片上下平行打孔，孔距2.5 mm。

1.1.3 主要仪器 UV2501-PC 型紫外扫描仪（日本岛津Shimadzu 公司）、酶标仪（Bio-Tek ELX800 型）、各种规格移液枪（Eppendorf）、BS100S 型分析天平（北京赛多利斯公司）、DF-101S 型恒温加热磁力搅拌器（河南予华仪器公司）、高速冷冻离心机（HITACHI SCR20BC）、Freeze 6 型冷冻干燥机（Labconco 公司）、漩涡振荡仪、恒温水浴锅、ULT1386-3-V38 型低温冰箱（美国REVCO 公司）、DCD-172K 型常规冰箱（美国伊莱克斯公司）等。

1.1.4 试验动物 健康雄性2 月龄试验用清洁级新西兰大白兔50 只，体重为2.0～2.5 kg/只，3 种偶联率的人工抗原Er-BSA（7#、4#、6#），每种抗原分别采用3 种免疫程序进行免疫，将50 只试验兔随机分为9 组，每组5 只试验兔，阴性对照5 只。饲养管理，所用兔子分笼饲养，自由饮食。

1.2 试验方法

1.2.1 免疫抗原的制备 采用戊二醛法，将Er 与牛血清蛋白（BSA）偶联为复合物，再加入弗氏完全佐剂制成抗原乳剂。分别称取20 mg Er 盛于100 mL锥形瓶中和20 mg BSA 置于5 号试管中，并向试管中加入配好的PBS 溶液约3 mL，待BSA 完全溶解后转移到有Er 的锥形瓶中，再用PBS 洗涤试管且将BSA完全移入锥形瓶。待Er 溶解后，向锥形瓶中加入1，4-二氧六环10 mL，混匀。将磁力搅拌子放入反应器后把锥形瓶放在一个含少量水的大烧杯中，再将烧杯置于25 ℃水浴，开启搅拌器，约5 min 后，保持搅拌状态，向反应器内逐滴加0.25%戊二醛溶液5 mL，滴加完毕后仍保持搅拌状态，反应4 h 以上；然后将反应液装入透析袋中用碱性透析液（碳酸钠10 g/L，EDTA 1 mol/L）透析72 h，每4 h 换液一次，透析后离心，上清液冷冻干燥，4 ℃保存。抗原和弗氏完全佐剂或不完全佐剂以1∶1 的比例乳化。

1.2.2 包被抗原的合成 反应过程同“1.2.1”方法，只需将BSA 换成OVA 即可。

1.2.3 免疫方案确定 本试验设计了3 种免疫程序的试验组进行免疫试验，具体免疫技术方案如表1所示。

表1 试验动物免疫技术方案

首先取1 mg/mL（以载体蛋白含量计算）人工抗原解冻，在无菌状态下以适量生理盐水稀释后，滴加到等体积的佐剂（FCA 或FICA）中，混合乳化后成油包水（W/O）状态用灭菌水使免疫的最终浓度为1 mg/mL，据表1 技术方案各组分别进行相关程序执行。免疫前和3 免疫后开始每次免疫后一周采耳缘静脉血1 mL，4 ℃放置4 h 后3 000 r/min 离心10 min取血清，将血清与甘油（1∶1）等体积混和，保存于-20 ℃冰箱，用于试血。各组于尾免后7 d 采用心脏直接采血法采血，20～30 mL/只；按“1.2.1”方法分离血清，分装和保存。

1.2.4 抗体效价的初步测定 血清效价的初步检测采用琼脂双向免疫扩散法测定，具体设计方法为，上排孔加入抗原Er-BSA 或Er-OVA，下方孔依次是2、4、8、16、32 倍稀释的抗Er-BSA 血清和阴性血清。判定标准，经37 ℃保温24 h 后观察抗体与抗原孔之间有无沉淀线产生，若有，则可判为阳性，同时借以判定是否有特异性的抗体产生以及抗血清的效价，当效价在1∶16 以上即可决定放血。

2 结果与分析

2.1 人工抗原的紫外光谱鉴定

采用UV2501-PC 型紫外扫描仪对Er、BSA、OVA 和2 种制备抗原进行紫外全波段扫描，波长范围在200～400 nm［8-11］。结果表明，Er 标准品紫外最大吸收波长为279 nm，BSA 紫外最大吸收波长为278 nm。当Er 与BSA 偶联形成免疫抗原后，其紫外最大吸收波长偏移至Er 和BSA 特征峰之间，提示本次合成得到Er与BSA偶联的免疫抗原Er-BSA（图2）。而Er 和OVA 偶联产物的紫外全波段扫描曲线比反应物OVA 峰形缓，278 nm 的最大吸收峰稍向左移，形状更接近于Er，初步说明偶联成功（图3）。此外，此次所得Er-OVA 产物曲线比之前的Er-BSA 曲线稍有波动，可能与反应物纯度有关。BSA 的纯度达98%，而OVA 纯度不到90%。其抗原偶联比、免疫抗原Er-BSA 和包被抗原的偶联比均为26∶1。

图2 免疫抗原与BSA、Er 紫外全扫描

图3 包被抗原与OVA、Er 紫外全扫描

2.2 琼脂双向免疫扩散法测定抗血清效价

用琼脂双向免疫扩散法测定抗血清效价，上排孔为Er-BSA 免疫抗原时，其测定结果见表2。由表2 可知，4 免后B 组（加强免疫组）兔抗血清的效价最高，其中B 组7#抗原免疫家兔后获得的兔抗血清最高效价达16；A 组（常规组）效价中等，最高可达8；C 组抗血清效价最低，为2，应予以淘汰。

表2 琼脂双向免疫扩散法测定抗血清效价结果

4 免后，上排孔为Er-OVA 和Er-BSA 两种抗原时，兔抗血清沉淀线都可见，如图4 所示，由此说明，本试验中，加强组免疫程序的免疫效果较好，且能产生较高效价特异性强的抗体。

图4 琼扩法测定抗血清效价情况

3 讨论

Er 是一种仅具反应原性而不具免疫原性（抗原刺激机体发生特异性免疫反应，从而产生抗体的性质）的小分子半抗原，其结构中氨基和酚基均可作为偶联基团，但酚基偶联的效果不佳，故选用氨基为偶联基团，而将其与载体蛋白相连接的方法主要是重氮化法和戊二醛法。但用重氮化法合成全抗原，一般通过紫外扫描显示偶联物与载体蛋白的吸收峰完全重叠，故放弃此法［12-14］。戊二醛是常用的带有2个活性基团的双功能连接剂，借助其两端的醛基将载体和半抗原的氨基通过共价键连接在一起。本试验以戊二醛为偶联剂，将载体蛋白氨基与半抗原Er分子中D-Orn4 和Cit-9 上的氨基偶联，整个偶联反应在PBS 和二氧六环反应条件下进行，其中PBS 可稳定反应的pH，并为反应提供水溶液环境，二氧六环既可调整反应环境的极性条件，又能促进醛基的反应，最终获得全抗原Er-BSA 和Er-OVA，且通过紫外光扫描表明偶联成功［15，16］。

本试验中采用2 月龄2.0～2.5 kg 大白兔为免疫对象，主要是适宜的年龄和体重可减少免疫耐受率，同时增强免疫应答效果，以保证产生合格抗体。此外，免疫时采用皮内免疫方式，不仅能减少免疫剂量，而且更适合于如Er 类人工合成成本高、量少等微量抗原的使用；同时，该方式可替代静脉加强法，不仅减少工作量、降低成本，而且可减少过敏反应的致死率。

在测定抗血清效价时，A 组和C 组分别在4 免和5 免后，经检测其抗血清的效价较低，而B 组4 免后获得的抗血清已经符合试验要求，由于本试验合成的抗原数量有限、成本过高等局限，因此仅选择B 组而放弃其他免疫程序的试验组，进而没有进一步免疫其他试验组的试验动物。在抗血清特异性方面，因为用Er-BSA 免疫动物产生的抗体有抗Er 和抗BSA 抗体，结果显示，当Er-BSA 为上排孔抗原时出现阳性，但这并不能证明抗Er 抗体的产生，因此用Er-OVA 抗原进行验证，仍可见有明显沉淀线，表明BSA与Er-BSA、Er-OVA 及OVA均不发生交叉反应。