商业化试剂构建荧光探针用于肼的检测及防伪识别

南齐钰，熊知萌，梁文杰，陈杜刚，余响林，闫志国

武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430205

肼（N2H4），又名联胺，是一种无色有刺激性气味的油状液体［1］。其分子结构包含两个带孤对电子的氮原子和四个活泼的氢原子，具有强还原性和亲核性，主要用作抗氧化剂、催化剂、医药中间体和火箭燃料等［2-3］。但是，其在生产、运输、使用和处理过程中，一旦发生泄漏，很容易造成严重的环境污染［4-5］。同时，肼具有较好的水溶性和高毒性，易通过呼吸吸入和皮肤渗透方式进入人体内，造成肝、肺、肾及中枢神经的损伤［6-7］。中国国家卫生计生委及世界卫生组织认为肼是一种可能引发癌症的潜在的环境污染物，并规定单位体积内肼浓度不得超过0.06 mg/m3，短时间接触肼的容许浓度不得超过0.13 mg/m3［4，8］。因此，实现环境中肼含量的高效准确检测有利于污染防控和改善相关工作人员的工作环境。

目前，常用的肼检测方法有色谱- 质谱联用法、滴定法、分光光度法［9］和电化学方法［10］。这些方法受仪器价格昂贵、制样程序繁琐及检测周期长等因素限制，不利于实时实地的检测环境中的肼含量。相对而言，荧光分析法在降低检测成本的同时，表现出灵敏度高、选择性好、操作简单等特点［11］，在环境检测和疾病诊断领域中得到广泛关注［12］。因此越来越多用于肼检测的荧光探针得到报道，如：Lan 等［13］以喹啉衍生物为骨架构建强给- 受体结构的红色荧光探针QMM，肼与受体二氰基乙烯键发生加成反应后，分子中的受体强度显著减弱，从而导致探针的发射蓝移，产生绿色荧光，实现了肼的比率型检测；Liu 等［14］以香豆素为荧光团，以1-溴丁酰基为识别基团构建荧光探针，肼先与溴发生取代反应，接着与C=O 发生分子内的缩合反应，将识别基团从分子中脱除，从而开启香豆素的绿色荧光，实现肼的选择性检测；Jung等［15］以四苯乙烯为荧光团，通过肼与双键的缩合反应，改变分子原有的荧光淬灭效果，于橙光区实现荧光增强。已报道的用于肼检测的荧光探针分子主要以香豆素［16-18］、半花菁［19］、荧光素［20］、黄酮［21-22］等结构为母体，通过基团修饰，实现对肼的检测。然而，这些荧光探针依然有值得改进之处：（1）探针分子化学结构复杂，合成过程繁琐，危险化学试剂使用频率高，与当前提倡的“绿色化学”、“绿色合成”理念不符；（2）部分荧光探针在检测肼时，吸收和发射位于紫外或蓝光区域［16］，背景干扰大，且Stokes 位移较小［17］，易受到“自吸收”效应的干扰，降低检测灵敏度；（3）部分荧光探针［18］必须在高含量有机溶剂中才能检测肼，且极易受到其他化合物的干扰［22］，降低检测结果的准确性。

为解决上述问题，本工作寻找了一种结构简单的商业化试剂作为探针，用于环境中肼含量的测定，在降低检测成本的同时，还具有响应速度快、选择性好、灵敏度高等特点。该探针为2-羟基-4- 甲氧基苯甲醛（2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyde，代号XN），以醛基作为肼识别位点（图1）。在水环境中，醛基与肼发生快速的缩合反应，所得产物能形成分子内氢键，在激发态发生分子内质子转移（excited-state intramolecular proton transfer，ESIPT）作用，从而开启强的荧光信号，实现对肼的选择性检测。同时，我们制备了负载探针XN 的试纸条，成功检测了气相中肼的含量，并且建立了只有在肼溶液喷涂的情况下才能发光成像的防伪识别模型。

图1 探针XN 对肼的识别机制Fig.1 Recognition mechanism of XN to hydrazine

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

DHG-9246A 电热恒温鼓风干燥箱（巩义市予华仪器），FA2014 分析天平（上海舜宇），Lambda 365 紫外分光光度计（日本岛津），F-7600 荧光光谱仪（日本日立）。

二甲基亚砜、四氢呋喃、水合肼、氯化铵、三乙胺、氨水和氢氧化钠（分析纯，中国武汉申试化工）；次氯酸钠、苯胺（安徽安庆安耐吉）。

1.2 溶液配制

将探针XN 用DMSO 配制成浓度为1 mmol/L的母液。市售水合肼经过标定后浓度为16.7 mol/L，使用去离子水梯度稀释至1 mol/L，以及100、50、20、10 mmol/L，且每次使用时重新配制。三乙胺、氨水和次氯酸钠溶液配制方法：将市售溶液稀释至浓度为10 mmol/L 的储存液；苯胺、氯化铵和氯化钠配制方法：称取相应质量的固体溶解在一定体积的去离子水中配制成浓度为10 mmol/L 的储存液。测试体系配制：量取200 μL 乙醇和800 μL去离子水混合制成V（EtOH）：V（去离子水）＝2∶8混合测试体系。

1.3 光谱性质测试

光谱性质测试过程中，将10 μL 探针XN 母液和10 μL 水合肼储存液（10 mmol/L）一同添加至1 mL 含体积分数20%EtOH 的去离子水混合测试体系，室温条件下孵育10 min，于紫外分光光度仪中测得紫外-可见吸收图谱和荧光发射图谱；荧光滴定测试过程中，于测试体系中分别加入10 μL 探针XN 母液和不同体积（0~10 μL）的水合肼储存液（10 mmol/L），室温中孵育10 min 后测得荧光发射图谱；选择性测试过程中，于测试体系中分别加入10 μL 探针XN 母液和10 μL 不同干扰物的储存液，室温中孵育10 min 后测得荧光发射图谱。

1.4 试纸条制备

将探针XN 溶解在丙酮溶液中，配制成浓度为20 μmol/L 的储存液。将裁剪好的滤纸条（1 cm宽）浸没在上述储存液内5 s，取出于通风处晾干后再次浸没在上述储存液中。重复操作4 次。得到试纸条在荧光灯下观察，若未显示出明显荧光，即满足后续测试要求。

1.5 防伪识别

首先使用工具蘸取已配制的浓度为20 μmol/L的XN 四氢呋喃溶液，在滤纸上写下“WIT”字样，通风处晾干，至无任何肉眼可见痕迹。然后将100 mmol/L 的水合肼溶液喷洒至滤纸上，静置5 min 后用荧光灯照射，观察发光情况。

2 结果与讨论

2.1 光学性能测试

2.1.1 探针分子结构和肼的识别机制 2-羟基-4-甲氧基苯甲醛（XN）本身分子的共轭比较小，分子内给受体系不强，荧光信号很弱，但与肼能快速发生缩合反应，所得产物能形成分子内的氢键，进而发生ESIPT 作用，有望开启强的荧光信号（图1）。为验证XN 对肼的识别机制，我们将1 mmol 的探针与10 mmol 的肼混合搅拌，并通过核磁共振氢谱分析产物结构。如图2 所示，探针与肼反应后，原有的醛基信号峰（c，9.72）消失，而在8.59 处出现新的信号峰（c’），且与3.92（a，-OCH3）处信号峰的积分比值为2∶3，符和伯氨氢与甲氧基上氢原子数目之比，故认为探针XN 对肼的识别机制如图1 所示。这样，在肼的检测过程中，背景干扰小，信噪比高。相比较已有的报道［16-20］，荧光探针XN还具有以下特点：（1）探针XN 为商业化试剂，来源简单，成本低廉；（2）ESIPT 作用的发生，能得到较大的Stokes 位移，减少自吸收，进一步提高检测的灵敏度。

图2 探针XN 与肼反应前后的核磁氢谱图Fig.21H NMR spectra of XN in absence and presence of hydrazine

2.1.2 紫外和荧光光谱性质 如图3（a）所示，荧光探针XN 本身在250 nm 以上的范围里没有明显的吸收；而在加入100 μmol/L 肼之后，在280 nm和370 nm 处分别出现明显的吸收峰，表明荧光探针XN 与肼发生了化学反应，产生了新的化合物，吸收系数显著增强。如图3b 所示，未添加肼时，荧光探针XN 在485 nm 处只表现出微弱的荧光发射峰。而在加入肼之后，485 nm 处的荧光强度增强了20 多倍，Stokes 位移高达115 nm，进一步说明XN 与肼发生反应，并通过ESIPT 作用发射强的荧光信号。这些结果表明探针XN 有望用来可视化检测肼的含量。

图3 探针分子XN（20 μmol/L）对肼（100 μmol/L）反应前后的吸收图谱（a），发射图谱（b），λex=370 nmFig.3 Absorption（a）and fluorescence spectra（b）of XN（20 μmol/L）in absence and presence of hydrazine（100 μmol/L），λex=370 nm

2.1.3 选择性测试 生态环境是一个复杂的系统，有可能含有多种潜在的干扰物质，尤其是与肼官能团相似的无机氨和有机胺类，理论上也能与探针分子XN 发生反应。为了验证荧光探针XN 对肼分子的高选择性，我们分别测试探针XN 在含有肼、苯胺、氯化铵、三乙胺、氨水、氯化钠和次氯酸钠的水溶剂体系中的荧光信号变化情况［图4（a），浓度均为100 μmol/L］，并绘制成柱状图［图4（b）］。如图4（a）所示，在几种干扰物质存在条件下，只有氨水能够造成轻微的荧光信号增强，而其他物质均不会改变溶液荧光的信号。这是因为氨水（NH3·H2O）有类似于肼（NH2-NH2）的伯胺结构，具有较强的亲核性，也能够与苯甲醛发生化学反应；但是其亲核能力却明显弱于肼，可能由于氨水在溶液中部分形成共轭酸NH4+，降低了反应活性，所以添加氨水的测试体系的荧光强度只有肼的1/3。同时，也测试了在干扰物共存下探针的检测性能，如图4（c）所示，在检测肼时探针显示出了良好的抗干扰能力。这些结果表明荧光探针XN 能够选择性地检测环境中的肼，尤其是可用于生产或使用肼的相关工厂水样中肼残余浓度的监测。

图4 探针XN（20 μmol/L）对肼（100 μmol/L）测定的选择性和抗干扰能力实验结果图：（a）荧光图谱，（b）和（c）相对荧光强度直方图Fig.4 Selectivity and anti-interference of XN（20 μmol/L）during detection of hydrazine（100 μmol/L）：（a）fluorescence spectra，（b）and（c）histograms of relative fluorescence intensity

2.1.4 线性范围及检测限 为探究荧光探针XN对肼的检测灵敏度，我们在混合溶剂体系中进行了荧光滴定实验。如图5（a）所示，随着加入肼的浓度逐渐增加，溶液的荧光也逐渐增强。当肼的浓度达到100 μmol/L 时，荧光强度达到最大值并饱和。之后，继续添加肼，荧光也不再变化。以探针XN 的相对荧光强度Fi/F0（Fi：添加肼后485 nm处荧光强度；F0：未添加肼时485 nm 处荧光强度）对肼的浓度作线性关系图，发现在10~100 μmol/L范围内，Fi/F0对肼浓度呈良好的线性关系［图5（b）］，拟合方程为：y=0.218x+0.157（R2=0.989）。依照3σ/κ的方法计算探针XN 的检测极限为69 nmol/L。表明荧光探针XN 能够高灵敏地检测溶液中肼的含量。

图5 探针XN 荧光滴定图谱（a）及曲线（b）Fig.5 Fluorescence titration spectra（a）and curve（b）of XN in presence of hydrazine

2.2 应用实验

2.2.1 肼蒸汽检测 肼的易挥发特性，导致其在泄漏时不仅容易造成水源污染，同时也会造成空气污染，因此我们设计肼蒸汽检测实验［图6（a）］来考察荧光探针XN 对气相中肼含量的检测能力。将市售水合肼溶液用四氢呋喃稀释，得到浓度为100、50、20、10 和0 mmol/L 的水合肼储存液。将不同浓度的水合肼储存液倾倒至展缸中（约20 mL），于避光处静置1 h，以保证展开缸内充满肼蒸汽。将制备好的含荧光探针XN 的试纸条悬挂在展开缸内，于避光处静置10 min 后取出，通风处晾干，并在荧光灯下观察发光情况［图6（b）］。如图6（c）所示，经不同浓度肼蒸汽浸润后的试纸条，在日光下肉眼观察并无明显区别，而在便携式紫外灯（365 nm）的照射下，则表现出明显的荧光强度差异。比如未在肼蒸汽中浸润的试纸条，在日光下为白色，而在荧光灯下显示蓝色荧光；在肼蒸汽中浸润的试纸条，在日光下为白色，而在荧光灯下显示绿色荧光。当空气中肼含量升高时，绿色荧光也逐渐增强［图6（c）］，说明负载XN 的试纸条有能力实现便捷式检测空气中肼的含量。

图6 （a）负载探针分子XN 的试纸条的制备和检测肼蒸汽的示意图，（b）试纸条在荧光灯下发光情况，（c）负载探针分子XN 的试纸条经不同浓度肼蒸汽浸润后的比色图和荧光图Fig.6 （a）Schematic illustrations of preparation of XN-loaded paper strip；（b）Luminescence of paper strip under UV-lamp；（c）Colorimetric and fluorescent detection of hydrazine vapor with paper strip

2.2.2 防伪识别 当今社会假冒现象无处不在，广大消费者及诸多企业饱受坑害，因此防伪技术的研究具有十分重要的社会安全意义。目前，纸币和发票上常用的防伪材料包括有机染料、聚合物纳米材料、半导体纳米材料、稀土掺杂发光纳米材料、碳量子点等［23-24］，主要通过在特定条件下产生特殊标志实现防伪鉴别，鉴于探针XN 在肼的作用下能够发射强荧光，与传统防伪机理有异曲同工之妙，它也有望用于防伪标识。如图7 所示，以XN 的四氢呋喃溶液（20 μmol/L）为墨，在滤纸上书写“WIT”标志，通风处晾干后，滤纸并看不到任何变化；但是再将肼溶液（100 mmol/L）喷涂在滤纸上，在便携式紫外灯的照射下，则能够观察到明显的发射绿色荧光的“WIT”标志，说明可以通过探针XN 与肼的反应实现防伪鉴别。

图7 防伪实验示意图及荧光成像结果Fig.7 Schematic illustration of anti-counterfeiting identification

3 结 论

本工作将荧光探针技术与环境监测的需求紧密结合，报道了一种成本低廉的商业化试剂作为肼的荧光探针，该探针来源广泛、响应速度快、灵敏度高、选择性好，在水环境中对肼检测限低至69 nmol/L。同时还成功制备出了负载探针XN 的试纸条，借助便携式紫外灯，通过人眼敏感的绿色荧光信号，实现了气相中肼蒸气的梯度检测。最后，利用探针XN 对肼的高选择性，建立了一个简便的防伪模型，展现了探针在防伪识别中的应用潜力。