染发剂对蚕豆根尖细胞的遗传毒性研究

＊张乐 胡滢 宋家璇 左晨阳 刘羽

（延安大学石油工程与环境工程学院 陕西 716000）

染发剂是常见的能改变头发颜色的日用化妆品，染发剂是否具有致突、致癌和致突变作用，已成为人们普遍关注的问题[1]。目前，市面上的染发剂大多是氧化型染发剂，其主要成分是对苯二胺、间苯二胺等小分子苯胺染料显色剂H2O2等，双氧水和对苯二胺均在3类致癌物清单中，易在使用者中引发过敏、皮肤损害及眼损害[2-3]等问题。

微核是真核生物细胞染色体一种异常结构，微核的形成能用来反映环境诱变因子对染色体造成的损伤情况，是常用的遗传毒理学指标之一[4]。蚕豆的染色体分布均匀、有丝分裂清晰易察，蚕豆根尖微核实验常被作为研究遗传毒性的有效实验，它成本低、周期短、操作简易、可靠性和灵敏性较高，对于致突变性的检测十分有效[5]。本实验通过对染发剂中的对苯二胺和双氧水的蚕豆根尖微核实验，以探讨其对植物遗传毒性的影响，并对实际染发剂产品进行安全性评价，为减少环境污染、保护人群健康提供一定的理论依据和数据支撑。

1.材料与方法

(1)材料、试剂及仪器

实验材料：青皮蚕豆。

实验试剂：对苯二胺、偏重亚硫酸钠、盐酸、活性炭、碱性品红、无水乙醇、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、冰醋酸、四种市售染发剂。

实验仪器：恒温培养箱；紫外分光光度计；奥林巴斯显微镜；电热鼓风干燥箱；台式高速离心机；水浴锅；震荡器。

(2)实验方法

实验采用青皮蚕豆为原料，对苯二胺实验是使用质量浓度为3mg/L～1700mg/L的对苯二胺来对蚕豆根尖进行染毒处理；双氧水实验是使用质量分数为0.05%～12.5%的双氧水来对蚕豆根尖进行染毒处理；蒸馏水作为对照组进行的蚕豆根尖染毒处理。

①蚕豆根尖的浸种、催根及染毒

浸种、催根过程：青皮蚕豆种子在25℃环境下湿润的脱脂棉中浸种、催芽，直到蚕豆根尖长到2.00～3.00cm为止。分别配置好不同浓度的对苯二胺和双氧水溶液置于三角瓶中，选取3～6粒蚕豆幼苗浸染5h。四种染发剂按照配方进行均匀混合，对四组真发进行染色处理，头发长度约为30cm，质量20g，染发操作后用水冲洗，清洗后置入三角瓶中加水至250mL，取3～6粒根尖生长状况大致相同的蚕豆幼苗置于其中。

②根尖细胞的恢复培养及固定

染毒后的种子清洗后重新置于湿润的脱脂棉中恢复培养24h左右，从根尖顶端切取1cm长的幼根，加卡诺氏固定液固定24h。

③孚尔根染色、制片和镜检

将固定好的幼根分别用蒸馏水浸洗，HCl溶液水浴，使蚕豆根尖软化后再次清洗，利用席夫试剂染色，再用SO2洗涤液浸洗根尖，清洗后4℃保存。取2mm左右的根尖捣碎制片，找到细胞分散均匀、清晰的部位，400倍观察，在不同部位数出根尖有丝分裂数、微核数[6]。

④脂质过氧化（MDA）的检测

蚕豆根尖细胞的脂质过氧化丙二醛的测定采用分光光度法进行[6]。

(3)分析方法

每个实验组至少观察3个制片，每个制片观察1000个细胞，观察微核形成及有丝分裂情况，统计微核数目，计算微核率（MCN‰）、微核指数和有丝分裂指数（MI%）。MCN为观测到的含微核细胞数占观察到的细胞总数（1000个）的比例；微核指数为试验样本的微核率与对照样本的微核率，本实验对照组为蒸馏水；有丝分裂指数（MI）为100个细胞中含有的有丝分裂数目；MDA为蚕豆根尖细胞膜脂质过氧化最终产物丙二醛的含量。

计算方法如下：

MCN‰=（某测试样片的MCN数÷某测试样品观察到的细胞总数）×1000‰

MI%=（某测试样片的有丝分裂发生数÷某测试样片观察到的细胞总数）×100%

MDA的含量（μmol/g）=C×V×10-3/W

C（μmol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450

实验结果用EXCEL计算平均值和标准偏差，绘制曲线图，采用SPSS17.0软件对数据进行单因素方差分析。

2.结果与讨论

(1)四种市售染发剂蚕豆根尖细胞毒性实验

选择市售不同价位的四种染发剂对真发进行染色处理，选取处理后的头发放入到培养蚕豆根尖细胞的水溶液中，考察对蚕豆根尖细胞的影响。

从表1中可以看出四种染发剂处理后的头发蚕豆根尖细胞微核指数分别为3.12、2.83、1.13和1.39，微核形态如图1所示，同时有丝分裂指数明显下降。细胞内活性氧含量迅速增加，导致脂质过氧化物水平迅速提高，对生物体的正常生理功能造成影响。染发剂的脂质过氧化物含量也比对照组明显提高，说明因为染发剂中存在大量化学物质，这些化学物质会产生毒性作用，细胞机体正常形成受到影响。实验中选用的四种染发剂存在价格梯度为A＞C＞D＞B，而毒性效果由强到弱为A＞B＞D＞C，可见染发剂植物毒性与其售价关系不大，许多研究也表明染发剂会诱发头皮毛囊退化或其他皮肤问题。

图1 细胞微核形态

表1 4种染发剂诱导下蚕豆根尖细胞的MI、MCN及MDA的变化

(2)双氧水处理分析

双氧水是染发剂中的主要成分，观察不同质量分数的双氧水对蚕豆根尖细胞毒性的影响。由图2可知，空白对照的MCN在（6.07±1.74）‰，双氧水质量分数在0～3%的范围内的蚕豆MCN呈现明显的升高趋势，双氧水质量分数为3%时，MCN为（16.83±2.4）‰，达到峰值，当双氧水质量分数大于3%之后，MCN明显下跌后趋于平缓。双氧水质量分数小于3%时蚕豆根尖经过染毒后颜色赤红，并随着浓度的增加而加深，但是整个根尖仍存在韧性和柔软性，恢复培养后有白色嫩芽长出，双氧水质量分数在3%之后的根尖明显发黑变硬，恢复培养后根尖生长扭曲，且短小，出现部分坏种。双氧水质量分数大于12.5%以后根尖完全变黑变硬。MCN在双氧水质量分数为5%～12.5%范围内和空白对照组没有显著性差异，是因为过高浓度的双氧水对蚕豆根尖起到的严重抑制和损害作用已经完全大于植物本身的生长的能力，因此MCN因为生长抑制而变小。

图2 双氧水对蚕豆根尖MCN和MDA的影响

图中MDA随着双氧水质量分数变化的曲线，也表现出3%为峰值的前涨后跌，峰值为（3.87±0.37）μmol/g。实验中蚕豆生长状态相对应，数值变化趋势也可以看出MCN与MDA存在着一定的相关性。应用SPSS的双尾分析可知皮尔逊相关系数为0.868**.在0.01级别（双尾），相关性显著。

(3)对苯二胺数据分析

对苯二胺是染发剂中最常添加的物质之一，本实验观察不同质量浓度的对苯二胺对蚕豆根尖细胞毒性的影响。

由图3可知，蚕豆根尖的MCN值随着对苯二胺质量浓度的增大先增大再减小，150mg/L时MCN达到最大值17.74±2.71‰，对苯二胺质量浓度小于46mg/L时，蚕豆经过染毒之后根尖发灰，但是恢复培养后生长良好，当对苯二胺质量浓度大于75mg/L时，浓度增大根尖颜色逐渐变黑变硬，恢复培养后生长扭曲，当质量浓度达到1700mg/L时有一半的根尖细胞死亡。数据显示对苯二胺质量浓度在1200mg/L～1700mg/L时MCN值与空白和低浓度的差异显著性不大，其原因与双氧水染毒过程相同，均为蚕豆根尖产生的严重生长抑制使微核率明显减少，而非毒性降低所致。

图3 对苯二胺对蚕豆根尖MCN和MDA的影响

MDA数据的变化趋势与MCN相似，最大值出现在对苯二胺质量浓度为150mg/L时，此时MDA浓度为（3.68±0.42）μmol/g，MDA与MCN二者之间进行双尾分析后发现两者同样有0.01级别的显著的相关性。研究表明当环境中存在诱变剂时，逆境会对植物造成明显损伤，而植物也会同时形成对逆境的适应性，并产生抵抗力[7]。

3.结论

（1）市售四种染发剂蚕豆根尖细胞实验表明，染发剂实验结果与空白对照的差异存在显著性，说明染发剂具有一定的植物毒性。

（2）在对苯二胺质量浓度和双氧水质量分数分别为150mg/L和3%时，MCN达到最高,对应值为（16.83±2.4）‰和（17.74±2.71）‰，MDA也达到峰值，分别为（3.68±0.42）μmol/g和（3.87±0.37）μmol/g，并且和空白对照组呈现显著性差异，MDA与MCN存在显著相关性。

（3）随着污染物浓度的增大，MDA与MCN均因为毒性物质严重的生物抑制而导致数值下降，可结合蚕豆根尖细胞生长状况及硬化、死亡率最终判断毒性大小。