唾液腺腺样囊性癌患者的MAPK、MMP-2和MMP-9 及CD147 表达和价值

侯翌杰，何志超，夏苗

1.甘肃医学院附属医院口腔科，甘肃平凉 744000；2.甘肃医学院附属医院病理科，甘肃平凉 744000

腺样囊性癌占所有唾液腺恶性肿瘤的21%～24%，具有侵袭性强、恶性程度高、远处转移率高等特点，调查显示其远处转移率可达40%，增加死亡风险[1-2]。因此，积极诊治唾液腺腺样囊性癌尤为重要。近年来，外科手术联合放疗方案已成为治疗腺样囊性癌的理想方法，近远期效果显著，存活率高[3-4]。值得注意的是，肿瘤的侵袭、转移过程尤具复杂性，特别是细胞外基质及基底膜的降解，参与了肿瘤的繁殖、生长、侵袭及转移过程[5-6]。本研究选取2020 年2 月—2022 年2 月甘肃医学院附属医院接诊的20 例唾液腺腺样囊性癌患者为研究对象，探究丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）、基 质 金 属 蛋 白 酶-2 （matrix metallo proteinase, MMP-2）、微血管密度（microvessel density, MVD）、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,CD147）、基质金属蛋白酶-9（matrix metallo proteinase, MMP-9）特点及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本院接诊的20 例唾液腺腺样囊性癌患者，将手术切除的腺样囊性癌组织设为A 组，包括男12例、女8 例；年龄29～70 岁，平均（43.49±4.25）岁。另外选择同期健康体检者20 例为B 组（正常唾液腺组织），包括男14 例、女6 例；年龄31～70 岁，平均（44.15±5.03）岁。两组基线资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究取得医学伦理委员会审核批准，且入组对象知晓研究并主动参与。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：病例资料完整；结合临床表现、病理检查等确诊为唾液腺腺样囊性癌。

排除标准：心理疾患、占位性病变、重要脏器功能衰竭等；术前接受放疗、化疗及其他相关抗肿瘤治疗；结合影像学检查确诊腺样囊性癌远处转移。

1.3 方法

1.3.1 试剂及仪器 SP 免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒、鼠抗人CD147 单克隆抗体、鼠抗人MMP-2单克隆抗体、MMP-9 兔抗人多克隆抗体、苏木精复染液、磷酸化MAPK（p-JNK、p-P38）等。

1.3.2 免疫组化方法 标本经甲醛溶液固定、石蜡包埋等处理后，制成切片（厚度4 μm），再进行防脱片处理。按照SP 免疫组化试剂盒说明书，测定石蜡标本切片内MMP-2、MMP-9 的表达。预试验，确定合适的一抗稀释浓度，1:200、1:200、1:150、1:100、1:75。经枸橼缓冲液微波加热处理，抗原修复15 min 后进行 DAB 显色。再进行苏木精复染、脱水、封片。

1.3.3 结果判定 同一组医生进行阅片，给出最终结 论。MMP-2、CD147、MMP-9 蛋 白 在 细 胞 质 及（或）间质着色，参考相关文献予以评分，即备好切片，借助400 倍镜作用，从中采集10 个视野，至少含有200 个细胞，对阳性细胞数目进行计算、统计。判定标准如下：无阳性细胞：阴性（-）；弱阳性（+）:r＜10%；阳性（++）:10%≤r＜50%；强阳性（+++）：r在50%及以上。阳性细胞率＝[（弱阳性细胞数+阳性细胞数+强阳性细胞数）/计数细胞总数]×100%。

MVD 的计算：直径＞10 个红细胞的血管不进行计数。计数方法：在低倍镜作用下观察切片，确定高血管密度区（热点），再经高倍镜作用，确定被染成棕黄色的血管数目，并计数4 个高倍镜视野下血管数目，取平均值。

1.4 观察指标

比 较A 组 与B 组MMP-2、MMP-9、MVD、CD147、MAPK 及 其c-Jun N-末 端 激 酶（Jun Nterminal kinase，JNK）、马氏珠母贝丝裂原活化蛋白激酶p38（PmMAPK，p-P38）表达水平，以及A 组中MMP-2、MMP-9 、MVD 、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）的相关性分析。

1.5 统计方法

采用SPSS 25.0 统计学软件分析数据，符合正态分布的计量资料以(±s)表示，行t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A 组与B 组MMP-2、MMP-9、MVD 、CD147及MAPK（p-JNK、p-P38）表达水平的比较

A 组MMP-2、MMP-9、MVD、CD147 表达水平高于B 组，MAPK（p-JNK、p-P38）表达水平低于B 组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 A 组与B 组MMP-2、MMP-9、MVD 、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）表达水平的比较(±s)

表1 A 组与B 组MMP-2、MMP-9、MVD 、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）表达水平的比较(±s)

组别A 组（n=20）B 组（n=20）t 值P 值MMP-2（ng/mL）3.09±0.87 1.31±0.49 7.972＜0.001 MMP-9（ng/mL）8.11±1.75 1.45±0.51 16.340＜0.001 MVD 值（%）20.13±4.40 4.75±1.41 14.886＜0.001 CD147 0.59±0.17 0.15±0.07 10.703＜0.001 MAPK p-JNK 0.67±0.05 1.05±0.07 19.755＜0.001 p-P38 0.31±0.03 0.97±0.05 50.620＜0.001

2.2 A 组 中MMP-2、MMP-9、MVD、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）的相关性分析

将p-JNK、p-P38 以阳性强度分组，形成p-JNK阴性/阳性组，p-P38 阴性/阳性组；p-JNK 阳性/阴性组中，MMP-9、MVD 水平情况相近，差异无统计学意义（P＞0.05）；p-JNK 阳性组中，MMP-2、CD147 水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；p-P38 阳性/阴性组中，MMP-2、MMP-9、MVD 水平相近，差异无统计学意义（P＞0.05），CD147 水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。经Spearman 系数显示，p-JNK 与MMP-2、CD147 存在相关性（P＜0.001），p-P38 与CD147 存在相关性（P＜0.001），见表3。

表2 p-JNK、p-P38 阴性/阳性中MMP-2、MMP-9、MVD 表达情况(±s)

表2 p-JNK、p-P38 阴性/阳性中MMP-2、MMP-9、MVD 表达情况(±s)

指标p-JNK p-P38组别阳性（n=14）阴性（n=6）t 值P 值阳性（n=18）阴性（n=2）t 值P 值MMP-2（ng/mL）8.41±1.11 4.21±0.51 8.775 0.001 7.15±1.03 6.37±0.89 1.023 0.320 MMP-9（ng/mL）136.41±29.33 135.19±27.61 0.087 0.932 134.37±26.21 133.59±24.41 0.040 0.968 MVD 值（%）2.89±0.49 2.77±0.53 0.490 0.630 2.83±0.45 2.71±0.49 0.356 0.726 CD147 0.71±0.25 0.25±0.11 4.281＜0.001 0.63±0.17 0.23±0.09 3.222 0.005

表3 A 组中MMP-2、MMP-9、MVD、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）的相关性分析

3 讨论

唾液腺腺样囊性癌发生机制复杂，具有生长缓慢、广泛侵袭、远处转移风险高、局部复发高等特点，可危及生命[7-9]。研究指出，在肿瘤的侵袭、转移过程中病灶对细胞外基质成分、基底膜的降解占据了重要的地位，尤其是基质金属蛋白酶家族对细胞基底膜、细胞外基质的降解作用[10]。目前，MMP-9、MMP-2 被认为与肿瘤的侵袭、生长相关，前者是基质金属蛋白酶家族的重要成员之一；后者可使基底膜、包绕肿瘤的基质降解，促进肿瘤的浸润、转移及血管的生成、毛细血管的增生[11-12]。CD147 作为一种糖蛋白，既能诱导肿瘤周围间质成纤维细胞，刺激MMPs 的大量分泌，又能降解细胞的基质、基底膜。MVD 是肿瘤血管新中的敏感性指标。正常成熟血管内皮细胞内MVD 呈弱表达，而增殖血管内皮细胞内的MVD 呈过度表达。MAPK 是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是信号从细胞表面传导至细胞核内部的重要传递者。MAPK 信号通路分布在大多细胞内，类型较多，如P38、JNK 等[13]。MAPK 在激素、细胞因子等不同细胞外因子刺激作用下可使细胞增殖、分化、迁移[14]。目前，MAPK 通路是研究最多的激酶通路，其中细胞外信号调节激酶ERIC、p38 激酶参与调节细胞功能，尤其是p38 激酶，能够促进细胞凋亡、抑制细胞增殖。

本研究结果显示，A 组MVD、CD147、MMP-2及MMP-9 表达水平较B 组高，MAPK（p-JNK、p-P38）表达水平低于B 组，说明了MMP-2、MMP-9、MVD、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）变化参与了唾液腺腺样囊性癌患者的发生、发展。细胞株中的细胞外刺激因子可使ERIK 激活，以及调节下游目的基因，促进MMP-2、MMP-9 的分泌，二者均是唯一可降解IV 型胶原的基质蛋白酶5，也可促进新生血管的生成，以为肿瘤细胞的生长提供条件，使肿瘤侵袭进、转移。因此，认为激活MAPIK 信号通路，以及上调MMP-2、MMP-9、CD147、MVD 的高表达，可加快患者病情进展。经Spearman 系数显 示，经Spearman 系 数 显 示，A 组 与MMP-2、CD147 存在相关性（r=0.584、0.687，P＜0.001），p-P38 与CD147 存在相关性（r=0.650，P＜0.001），与张彬等[15]提出的研究成果相符，p-P38 与MMP-2、MMP-9 表达 呈 正 相 关(r=0.824、0.768），p-JNK 与MMP-2、MMP-9 表达呈正相关（r=0.581、0.604)，充分证实了本研究结论的真实性、可靠性，也说明了MAPK/ MMPs 通路参与了唾液腺腺样囊性癌的侵袭、转移复杂过程，为此建议以此为治疗靶点，选择合理的治疗方法，确保提高临床疗效，延长患者生存期限。

综 上 所 述，MMP-2、MMP-9、CD147、MVD 及MAPK（p-JNK、p-P38）在唾液腺腺样囊性癌患者中呈高表达，与唾液腺腺样囊性癌呈正相关。