miR-652-5p 在肝细胞癌患者血清中的表达水平及临床意义

徐海燕 蒙积丽 符韶曲 李菲菲

肝细胞癌（HCC）是一种恶性程度较高的消化系统肿瘤，尽管近年来HCC 的诊断和治疗取得了较大突破，但HCC 患者的生存率仍较低[1]。miRNA是一类长度为20～25 个核苷酸的非编码RNA，其通过调节肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡及迁移，在HCC 的发生和进展中起着重要作用[2-3]。研究发现miR-652 在HCC 患者肿瘤组织中表达上调，其过度表达促进了肿瘤细胞增殖，可为HCC 的诊断及治疗提供参考[4]。甲胎蛋白（AFP）是目前临床上已被广泛应用于HCC 诊断的肿瘤标志物，在HCC 的辅助诊断和疗效监测方面具有重要意义[5]。异常凝血酶原-Ⅱ（PIVKA-Ⅱ）是一种主要由肝细胞合成的前体蛋白，其表达水平升高与肝细胞病变有关，在HCC 的早期诊断和预后预测方面具有较好的应用前景[6]。目前关于miR-652-5p 联合AFP 及PIVKA-Ⅱ在HCC 诊断中的应用价值尚未明确。本研究检测了HCC 患者的血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ表达水平，并分析3 项联合检测对HCC 的诊断价值，旨在为HCC 的诊疗提供参考依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择2019 年1 月至2022 年3 月东方市人民医院和海南医学院第二附属医院收治的105 例HCC患者和60 例肝硬化患者，分别设为HCC 组和肝硬化组。纳入标准：（1）HCC 的诊断符合《原发性肝癌诊疗规范（2019 年版）》[7]中的诊断标准，肝硬化的诊断符合《肝硬化诊治指南》[8]中的诊断标准；（2）均为HBV 感染者；（3）入组前均未曾接受HCC 相关治疗。排除标准：（1）合并其他肝炎、恶性肿瘤及免疫系统疾病者；（2）临床资料不完整；（3）近1 个月内曾服用激素、免疫抑制剂等。HCC 组中男性68 例，女性37 例，年龄42～79 岁，平均年龄为（56.93±8.42）岁；肝硬化组中男性39 例，女性21 例，年龄40 ～78 岁，平均年龄为（56.70±8.53）岁。另选取50 名同期于该院进行体检的健康志愿者设为对照组，其中男性30 名，女性20 名，年龄42～76 岁，平均年龄为 （57.15±7.84）岁。所有受试者均知情同意并签署同意书，本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 临床资料收集

收集所有受试者的临床基线资料，包括性别、年龄、吸烟史（连续或累计吸烟≥6 个月）、饮酒史（连续或累计饮酒≥12 个月）、血小板计数（PLT）、ALT、AST 和总胆红素（TBil）等。105 例HCC 患者中，TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期67 例，Ⅲ～Ⅳ期38 例；高分化28 例，中分化43 例，低分化34 例；有远处转移26 例，有门静脉癌栓20 例。

1.3 血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ的表达水平检测

采用实时荧光定量PCR 法检测各组的血清miR-652-5p 表达水平。HCC 组和肝硬化组于入院次日采集空腹肘静脉血5 mL，对照组在体检时采集空腹肘静脉血5 mL，3 500 r/min 离心10 min，分离血清。使用ABI 7500 型PCR 仪检测miR-652-5p表达水平，反应条件为：95 ℃预变性10 min；之后94 ℃变性15 s，55 ℃退火 30 s，70 ℃延伸30 s，共40 个循环。以U6 作为内参，采用2-△△Ct法计算miR-652-5p 的相对表达量。另使用罗氏Cobas e601型全自动电化学发光分析仪及配套试剂盒[购自罗氏诊断产品（上海）有限公司]测定血清AFP 和PIVKA-Ⅱ表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 统计学方法

应用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用SNK-q检验，2 组间比较采用成组t检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用ROC 曲线分析血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ表达水平对HCC 的诊断价值。采用Pearson 相关系数法分析HCC 患者的血清miR-652-5p 表达水平与血清AFP 和PIVKA-Ⅱ表达水平的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组临床基线资料比较

HCC 组和肝硬化组血清ALT、AST 和TBil 水平均显著高于对照组，且肝硬化组的TBil 水平显著高于HCC 组，差异均有统计学意义（P均＜0.001）。3 组的性别、年龄、吸烟史、饮酒史和PLT 水平差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

2.2 各组血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ的表达水平比较

HCC 组的血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ表达水平均显著高于肝硬化组和对照组，且肝硬化组的血清miR-652-5p 和AFP 表达水平均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P均＜0.001）。见表3。

表3 各组血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ的表达水平比较

2.3 血清miR-652-5p 表达水平与HCC 患者临床病理特征的关系

结果显示，TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有门静脉癌栓和有远处转移的HCC 患者的血清miR-652-5p 表达水平分别高于Ⅰ～Ⅱ期、中～高分化、无门静脉癌栓和无远处转移的HCC 患者，差异均有统计学意义（P均＜0.001）。见表4。

表4 血清miR-652-5p 表达水平与HCC 患者临床病理特征的关系

2.4 血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ对HCC 的诊断价值

ROC 曲线分析结果显示，血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ表达水平诊断HCC 的最佳截断值分别为2.25、143.62 ng/mL 和177.15 mAU/mL。3 项联合检测诊断HCC 的AUC 均大于miR-652-5p（Z＝6.127，P＝0.000）、AFP（Z＝7.713，P＝0.000） 和PIVKA-Ⅱ（Z＝6.548，P＝0.000） 单项检测， 差异均有统计学意义（P均＜0.001），且联合检测的准确度最高（92.26%）。此外，与血清AFP 和PIVKA-Ⅱ比较，血清miR-652-5p 诊断HCC 的敏感度和特异度均较高。见表5 和图1。

图1 血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ诊断HCC 的ROC 曲线

表5 血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ对HCC 的诊断价值

2.5 HCC 患者血清miR-652-5p 表达水平与AFP 和PIVKA-Ⅱ表达水平的相关性

Pearson 相关性分析结果显示，HCC 患者的血清miR-652-5p 表达水平与血清AFP 和PIVKA-Ⅱ表达水平均呈正相关（r＝0.774，P＜0.001；r＝0.825，P＜0.001）。见图2。

图2 血清miR-652-5p 表达水平与血清AFP 和PIVKA-Ⅱ表达水平的相关性分析 A miR-652-5p 与AFP B miR-652-5p 与PIVKA-Ⅱ

3 讨论

HCC 是一种常见的恶性肿瘤，血清学标志物对于HCC 的早期诊断具有重要价值[8]。AFP 是常用的肿瘤标志物，但其诊断HCC 的敏感度不高，容易造成漏诊，存在一定的局限性。PIVKA-Ⅱ是一种新型肿瘤标志物，其诊断HCC 的敏感度较高，可作为AFP 阴性患者的辅助检测指标[9]。以往研究表明，PIVKA-Ⅱ可通过诱导HCC 细胞增殖、分化及血管生成而促进肿瘤进展，可作为HCC 早期筛查及预后判断的生物标志物[10]。miRNA 与肿瘤的发生、转移及复发等有关，在肿瘤的发生和进展过程中发挥着重要作用[11]。越来越多研究表明，miRNA 异常表达与HCC 的发生和预后有关，可为HCC 的诊断、预后预测和靶向治疗提供帮助[12-13]。miR-652-5p 具有高度稳定性且在血液中循环，研究表明其在食管鳞癌患者中异常表达，可通过调节不同靶基因影响肿瘤进展，在肿瘤的诊断和预后预测中具有重要价值[14]。

本研究结果显示，HCC 组的血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ表达水平均显著高于肝硬化组和对照组，这提示miR-652-5p 具有促癌作用，其高表达可能促进HCC 发生。王雪容等[15]的研究表明，miR-652 可以通过调节细胞增殖、迁移和侵袭参与HCC 病程进展，可作为HCC 潜在的诊断和预后生物标志物。本研究还发现，TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有门静脉癌栓和有远处转移的HCC 患者的血清miR-652-5p 表达水平分别高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、无门静脉癌栓和无远处转移者，这提示miR-652-5p 可能促进了HCC 的进展。Peng 等[16]的研究发现，miRNA 在HCC 组织中异常表达，其参与了肿瘤细胞的增殖、迁移及凋亡过程，在HCC 的发生和进展中起着重要作用，并可用于临床诊断早期HCC。

Ziogas 等[17]的研究发现，miRNA 在HCC 细胞增殖、迁移和侵袭中发挥着促进作用，在HCC的诊断和预后预测中具有较好的应用前景。以往研究表明AFP、PIVKA-Ⅱ与HCC 的发生和进展有关，但AFP 单独诊断HCC 的效能较低，而AFP与PIVKA-Ⅱ联合检测可提高对HCC 的诊断效能（AUC 为0.854）[18]。另有研究表明，HCC 患者的血清PIVKA-Ⅱ和AFP 表达水平均显著高于良性肝病组和健康对照组，2 项联合检测诊断HCC 的敏感度和特异度均较高，对诊断早期HCC 具有重要的临床意义[19]。本研究结果显示，血清miR-652-5p 诊断HCC 的敏感度和特异度均较高，且其与血清AFP及PIVKA-Ⅱ联合检测诊断HCC 的AUC 较大，这提示3 项联合检测对HCC 的诊断价值较高。本研究还发现，HCC 患者的血清miR-652-5p 表达水平与血清AFP 及PIVKA-Ⅱ表达水平均呈正相关。

综上所述，HCC 患者的血清miR-652-5p 表达上调，其参与了HCC 的发生和进展过程。血清miR-652-5p 与血清AFP 及PIVKA-Ⅱ联合检测有助于提高HCC 诊断的准确度，有潜力作为诊断HCC的生物标志物组合检测方案。本研究的样本量较小，可能使结果产生偏倚，有待今后扩大样本量进一步验证本研究结论。