lncRNA TMPO-AS1 在食管癌组织中的表达及临床意义

王鹏飞 施磊健 崔宝生 周骁宇 张 洁

食管癌（EC）的发病率较高，目前临床治疗主要包括手术治疗、放射治疗和化学治疗等，患者的预后较差[1-2]。EC 的发病与饮食习惯、家族遗传史、抑癌基因失活及促癌基因激活等有关[3-4]，其发病机制尚未完全明确，探索EC 发病的分子机制，对早期诊治EC 具有重要意义。研究表明长链非编码RNA（lncRNA）和miRNA 均参与了EC 的发生和进展[5-6]。胸腺生成素反义RNA1（TMPO-AS1）是一种lncRNA，其在EC 组织中呈高表达，可促进EC 细胞增殖、侵袭，其可能是治疗EC 的潜在靶标[7]。miR-498 在EC 组织中呈低表达，可通过影响细胞自噬发挥抑癌作用，其也可能是治疗EC的潜在靶标[8]。Gao 等[9]的研究发现，TMPO-AS1可通过靶向调节miR-498 表达水平，进而调节EC的进展。目前TMPO-AS1 在EC 组织中的表达情况，以及其与miR-498 表达及EC 患者预后的关系尚未明确，本研究对此进行了探索，以期为EC 患者的临床诊治及预后预测提供参考依据。

1 临床资料与方法

1.1 临床资料

选取2016 年8 月至2019 年8 月南通大学附属启东医院收治的84 例EC 患者的EC 组织和癌旁组织（距EC 组织边缘≥4 cm）。84 例患者中男性49 例，女性35 例；年龄44～73 岁，平均年龄为（59.62±9.41）岁，＜60 岁41 例，≥60 岁43例；酗酒51 例，不酗酒33 例；肿瘤中、高分化57 例，低分化27 例；鳞癌54 例，腺癌30 例；肿瘤直径＜4 cm 44例，≥4 cm 40例；TNM分期Ⅲ期26例，Ⅰ～Ⅱ期58 例。

纳入标准：（1）经组织病理学检查初次确诊为EC；（2）入院前未接受靶向、免疫、放射及化学治疗；（3）入院检查资料及术后随访资料完善；（4）患者接受了EC 根治手术。排除标准：（1）既往有食管手术史；（2）合并严重心、肺、肝、肾功能障碍；（3）合并全身感染性疾病、血液及免疫系统疾病；（4）合并反流性食管炎、胃溃疡、Barrett 食管；（5）合并胃癌、胰腺癌或其他肿瘤。所有入选患者及家属均签署知情同意书，本研究获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 将手术切除的EC 组织和癌旁组织用0.9% Nacl 溶液清洗后立即置于液氮罐中，过夜后置于-80 ℃冰箱。

1.2.2 实时荧光定量PCR 法检测组织中TMPOAS1、miR-498 表达水平 在冰上研碎EC 组织和癌旁组织，加入TRIzol 试剂 （购自美国Invitrogen 公司）提取总RNA，应用EpiNext Hi-Fi cDNA Synthesis Kit试剂盒（购自美国Epigentek 公司）将总RNA 反转录成cDNA，应用Perfectstart SYBR Green qPCR master mix 试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）、实时荧光定量PCR 仪（购自美国ABI 公司）扩增cDNA，获取TMPO-AS1、miR-498 的循环阈值（Ct 值）。反应条件：98.5 ℃预变性8 min；之后96.5 ℃变性30 s，62.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40 个循环。lncRNA TMPO-AS1、miR-498 分别以GAPDH、U6 为内参，采用2-△△Ct法计算TMPOAS1、miR-498 相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 随访

对84 例EC 患者采用门诊复查或电话询问的方式定期随访36 个月，以EC 患者手术次日为随访起点，随访截至2022 年8 月30 日或以患者死亡为随访终点，记录EC 患者的生存情况。

1.4 统计学方法

应用SPSS 25.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用配对样本t检验；计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson 相关性分析探讨EC 组织中TMPO-AS1 与miR-498 的相关性。采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，以Log-Rank 检验分析EC 组织中TMPO-AS1、miR-498 表达水平与患者预后的关系。采用COX 回归分析探讨EC 患者预后的影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EC 组织和癌旁组织中TMPO-AS1、miR-498表达水平比较

与癌旁组织相比，EC 组织中TMPO-AS1 表达水平显著升高，miR-498 表达水平显著降低（P均＜0.05）。见表2。

表2 EC 组织和癌旁组织中TMPO-AS1、miR-498 表达水平比较

2.2 EC 组织中TMPO-AS1、miR-498 表达水平与患者临床病理特征的关系

因数据均符合正态分布，故以EC 组织中TMPO-AS1、miR-498 表达水平的平均值（2.29、0.41）为最佳截断值，将≤最佳截断值的EC 患者设为TMPO-AS1 低表达组（41 例）、miR-498 低表达组（44 例），将＞最佳截断值的EC 患者设为TMPOAS1 高表达组（43 例）、miR-498 高表达组（40 例）。χ2检验结果显示，EC 组织中TMPO-AS1、miR-498 表达水平与肿瘤分化程度、TNM 分期均有相关性（P均＜0.05），而与性别、年龄、是否酗酒、病理类型及肿瘤直径均无相关性（P均＞0.05）。见表3。

表3 EC 组织中TMPO-AS1、miR-498 表达水平与患者临床病理特征的关系/例（%）

2.3 EC 组织中TMPO-AS1 与miR-498 表达水平的相关性分析

Pearson 相关性分析结果显示，EC 组织中TMPO-AS1 与miR-498 表达水平呈负相关（r＝-0.567，P＝0.000）。见图1。

图1 EC 组织中TMPO-AS1 与miR-498 表达水平的相关性分析

2.4 EC 组织中TMPO-AS1、miR-498 表达水平与患者预后的关系

对84 例EC 患者随访36 个月，死亡34 例，总生存率为59.52%。Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示，TMPO-AS1 高表达组EC 患者的平均生存时间（25.95 个月，95%CI：22.98～28.93）短于TMPO-AS1 低表达组（33.39 个月，95%CI：31.55～35.23），Log-Rank 检验结果显示，TMPO-AS1 高、低表达组的累积生存率差异有统计学意义（χ2＝15.516，P＜0.001）；miR-498 低表达组EC 患者的平均生存时间（25.82 个月，95%CI：22.94～28.70）短于miR-498 高表达组（33.73 个月，95%CI：31.88～35.57），Log-Rank 检验结果显示，miR-498高、低表达组的累积生存率差异有统计学意义（χ2＝20.458，P＜0.001）。见图2。

图2 EC 组织中TMPO-AS1、miR-498 表达水平与患者预后的关系 A TMPO-AS1 表达水平与患者预后的关系 B miR-498 表达水平与患者预后的关系

2.5 EC 患者预后的影响因素分析

以分化程度（低分化＝0，中、高分化＝1）、TNM 分期（Ⅰ～Ⅱ期＝0，Ⅲ期＝1）、TMPO-AS1（低表达＝0，高表达＝1）、miR-498（高表达＝0，低表达＝1）为自变量，以EC 患者预后（预后良好＝0，预后不良＝1）为因变量进行分析。单因素COX 回归分析结果显示，分化程度、TNM 分期、TMPOAS1和miR-498均是影响EC患者预后的重要因素（P均＜0.05）。多因素COX 回归分析结果显示，TNM分期Ⅲ期、TMPO-AS1 高表达和miR-498 低表达均是影响EC 患者预后的独立危险因素（P均＜0.05）。见表4。

3 讨论

EC 患者的早期症状不明显，出现吞咽困难症状时患者多数已进展至晚期，预后较差[10-11]。因此，探索EC 发病的分子机制，寻找可以早期诊断EC及预测患者预后的生物标志物具有重要意义[12]。

lncRNA 是一类长度超过200 个核苷酸的RNA分子，不具备编码蛋白质功能，其可调控miRNA降解、染色质重构，参与EC 等多种肿瘤细胞的增殖、凋亡等生物学过程，与胃癌、结肠癌、EC 等肿瘤的病理变化相关[13-14]。有研究显示，TMPOAS1 在胃癌组织中表达上调，其可促进胃癌细胞增殖、迁移及血管新生，与患者的预后密切相关[15]。Luo 等[16]的研究发现，TMPO-AS1 在食管鳞状细胞癌组织中呈过表达，其可通过促进肿瘤细胞增殖、迁移进而促进食管鳞状细胞癌进展，提示TMPOAS1 可能是治疗食管鳞状细胞癌的分子靶标。本研究结果显示，EC 组织中TMPO-AS1 表达水平较癌旁组织显著升高，与吴恺等[7]的研究结果一致，提示TMPO-AS1 可能与EC 的病理变化有关，推测高表达的TMPO-AS1 可能通过靶向调节miRNA等相关基因的表达，促进EC 细胞侵袭、迁移、上皮-间质转化（EMT），并促进血管新生[7,16]，表明TMPO-AS1 在EC 中起着促癌作用，其具体机制有待深入研究。此外，本研究结果还显示，EC 组织中TMPO-AS1 表达水平与肿瘤分化程度、TNM 分期相关，提示TMPO-AS1 可能与EC 进展有关，检测EC 组织中TMPO-AS1 表达水平有助于评估EC患者的病情及指导治疗方案的制定。本研究进一步发现，TMPO-AS1 高表达与EC 患者累积生存率较低有相关性，表明TMPO-AS1 有潜力成为预测EC 患者预后的标志物。

miRNA 是一类长度为21～23 个核苷酸的内源性RNA 分子，其也不能编码蛋白质，可与信使RNA（mRNA）结合影响mRNA 的翻译和降解，进而调节靶基因的表达，参与EC 等肿瘤细胞的增殖、凋亡，影响血管新生，与肝细胞癌、EC 等肿瘤的发病密切相关[17-18]。有研究发现miR-498 在EC 组织中表达下调，其可抑制EC 细胞的侵袭、迁移和EMT，提示其参与了EC 的进展，可能是诊治EC的分子靶标[19]。此外，Jin 等[20]的研究发现，miR-498 在食管鳞状细胞癌组织中表达下调，其可与靶基因结合影响食管鳞状细胞癌的生长、转移。本研究结果显示EC 组织中miR-498 表达水平较癌旁组织显著降低，这与Li 等[8]和Wang 等[19]的研究结果一致，提示miR-498可能与EC发生和进展相关，推测miR-498 可能通过与靶基因结合影响EC 细胞的增殖、侵袭和EMT 等过程，从而影响EC 的病理改变。本研究还发现在低分化、TNM 分期Ⅲ期患者中，EC 组织中miR-498 呈低表达的患者占比较高，提示miR-498 可能与EC 进展相关，检测EC组织中miR-498 表达水平有助于评估EC 患者的病情及指导个体化治疗方案的制定，并提示miR-498可能是评估EC 疾病严重程度的生物标志物。此外，本研究结果显示，miR-498 低表达与EC 患者累积生存率较低有相关性，表明miR-498 有潜力成为预测EC 患者预后的生物标志物。

Gao 等[9]的研究发现TMPO-AS1 与miR-498的表达水平相关，因此本研究探讨了EC 组织中TMPO-AS1 与miR-498 表达水平的关系，结果显示两者呈负相关，提示TMPO-AS1 可能与miR-498 共同调控EC 的发生和进展，推测TMPO-AS1 通过与miR-498 靶向结合以协同影响EC 细胞的增殖、迁移和EMT，从而影响EC 的进展，但其具体机制仍有待深入探讨。本研究还发现，TNM 分期Ⅲ期、TMPO-AS1 高表达和miR-498 低表达均是影响EC患者预后的独立危险因素，提示检测EC 组织中TMPO-AS1、miR-498 表达水平有助于早期诊治EC及预测预后。

综上所述，EC 组织中TMPO-AS1 表达上调，miR-498 表达下调，两者呈负相关。TMPO-AS1 和miR-498 与肿瘤分化程度、TNM 分期及患者预后等均显著相关，有助于评估EC 患者的病情及预后预测。由于本研究的样本量较小，对患者的随访时间较短，可能使结果产生偏倚。今后将增大样本量，延长随访时间，并进行多中心研究，以进一步验证本研究结论。