CDK5RAP1 通过Wnt/β-Catenin 信号通路调控结直肠癌发生和进展的研究

蒋漫琦 何师茜 杨 洪 周晓倩

结直肠癌（CRC）是消化道常见恶性肿瘤，CRC 患者的早期症状不明显，多数患者确诊时已处于晚期，从而增加了临床治疗的难度[1]。因此，亟需探索新的靶点以提高CRC 的疗效。多条信号通路失调在CRC 的发生和进展中起着重要作用。Wnt/β-连环蛋白（β-Catenin）信号过度激活可促进CRC 的发生和进展[2]。研究表明可通过抑制Wnt/β-Catenin 信号通路以抑制CRC 细胞的增殖、迁移和侵袭[3]。周期素依赖性激酶5 激活结合蛋白1（CDK5RAP1）与细菌MiaB 蛋白同源，是一种自由基S-腺苷蛋氨酸（SAM）酶[4]。CDK5RAP1与细胞凋亡间的关系已得到证实，研究发现CDK5RAP1 缺乏可以通过活性氧/c-Jun N 末端激酶（ROS/JNK）信号通路诱导乳腺癌细胞的周期停滞和凋亡[5]。目前鲜有CDK5RAP1 在CRC 发生和进展中作用的相关研究报道，本课题组的前期研究结果显示，CRC 组织中CDK5RAP1 的表达水平显著高于癌旁组织，推测其可能参与了CRC 发生和进展的调控。本研究探讨了CDK5RAP1 通过Wnt/β-Catenin 信号通路对CRC 发生和进展的影响及机制，以期为CRC 患者的临床治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2020 年6 月至2022 年9 月在贵阳市第一人民医院被首诊为CRC 的72 例患者的CRC 组织和癌旁组织（距肿瘤组织边缘＞3 cm）。所有患者在术前均未接受化学治疗、放射治疗或其他抗肿瘤治疗。将手术切除组织分成2 份，1 份组织用于实时荧光定量RCR 法检测，另1 份用4%多聚甲醛溶液固定后用于免疫组织化学染色分析。本研究获得医院医学伦理学委员会批准，所有入选者均签署知情同意书。

本研究采用的人CRC 细胞系HCT-116、SW480、HT29、SW620、Caco-2 及人正常结直肠上皮细胞系NCM460 均购自中国科学院上海细胞库。18 只4～5 周龄BALB/C 裸鼠，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，本研究获得医院动物伦理委员会批准。

1.2 实验试剂

CCK-8 试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Wnt 激活剂HLY78 购自美国MCE 公司；Matrigel 基质胶购自美国BD 公司；TRIzol 试剂购自杭州新景生物试剂开发有限公司；Aurum Total RNA Mini Kit 试剂盒和iScript™ cDNA Synthesis Kit试剂盒均购自美国BIO-RAD 公司；Lipofectamine®3000 转染试剂购自美国Invitrogen 公司；β-Catenin、Axin1、c-Myc、CD133、CD44、SOX2、β-actin 一抗和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔（ab288151）二抗均购自英国Abcam 公司。

1.3 细胞培养

所有细胞均在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养，置于5% CO2、37 °C 细胞培养箱中。

1.4 细胞转染与分组

将各CRC 细胞以1×105个/孔的密度接种至6 孔板，待细胞密度为60%～70% 时，使用Lipofectamine®3000 转染试剂分别将si-NC 和si-CDK5RAP1 转染至HCT-116 细胞中，分别将pc-NC和pc-CDK5RAP1 转染至SW480 细胞中，再培养48 h 以备后续实验。将SW480 细胞分为SW480-CON 组（正常培养细胞）、SW480-pc-NC 组（阴性对照细胞，转染CDK5RAP1 过表达质粒pc-NC）、SW480-pc-CDK5RAP1 组（过表达细胞，转染CDK5RAP1 过表达质粒pc-CDK5RAP1）和SW480-HLY78 组（SW480-pc-CDK5RAP1+20 μmol/L Wnt激活剂HLY78）[6]，将HCT-116 细胞分为HCT-116-CON 组（正常培养）、HCT-116-si-NC 组（阴性对照细胞，转染CDK5RAP1 siRNA si-NC）、HCT-116-si-CDK5RAP1 组（低表达细胞，转染CDK5RAP1 siRNA si-CDK5RAP1）和HCT-116-HLY78 组（HCT-116-si-CDK5RAP1+20 μmol/L HLY78）[6]。

1.5 实时荧光定量PCR 法检测组织和细胞中CDK5RAP1 的表达情况

使用Trizol 试剂提取组织和CRC 细胞中的总RNA，测定其浓度，使用逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA，使用实时荧光定量PCR 仪进行扩增。以GAPDH 为内参，采用2-△△Ct法计算目标基因CDK5RAP1 的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 免疫组织化学染色法检测组织中CDK5RAP1的表达情况

将组织固定、脱水、石蜡包埋、切片（5 μm 厚），将组织切片经TRIS 缓冲盐溶液预孵育后，用10%山羊血清封闭，与CDK5RAP1 一抗在4 ℃下孵育过夜，再与二抗在室温下持续孵育2 h，DAB 显色后行苏木精复染，在显微镜下观察并拍照。

1.7 CCK-8 法检测CRC 细胞增殖情况

将各组CRC 细胞以1×104个/孔的密度接种至96 孔板培养48 h，弃上清，每孔加入含10 μL CCK-8 的完全培养液100 μL，37 ℃下孵育2 h，使用酶标仪检测495 nm 处的吸光度（OD），并计算细胞存活率。实验设置空白孔（不加细胞，只加培养液）调零。细胞存活率＝（OD实验-OD空白）/（OD对照-OD空白）×100%，其中OD实验为基因过表达组或基因敲低组细胞的OD 值，OD对照为CON 组细胞的OD 值，OD空白为空白孔的OD 值。

1.8 平板克隆实验检测CRC 细胞的克隆情况

将各组CRC 细胞接种至6 孔板（500 个/孔），37 ℃下培养14 d 后，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，用0.5%结晶紫染色，水洗，干燥，肉眼计数克隆的细胞数。细胞克隆率＝细胞克隆数/细胞接种数×100%。

1.9 Transwell 实验检测CRC 细胞的侵袭能力

使用基础培养液重悬各组CRC 细胞，使其密度调整为5×105个/mL。Transwell 小室预涂有稀释后的Matrigel 基质胶（预冷基础培养液以1 ∶3 体积比稀释）。将200 μL 细胞液加入上室，下室加入500 μL 完全培养基，在37 ℃下孵育48 h 后，用4%多聚甲醛溶液固定下室细胞10 min，用0.1%结晶紫染色30 min。在显微镜下随机选取5 个视野计数细胞侵袭数量，结果取平均值。

1.10 划痕愈合实验检测CRC 细胞的迁移能力

将各组CRC 细胞以1×105个/孔的密度接种至6 孔板，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，用10 μL 移液枪枪头竖直向上划痕，在显微镜下拍照并记录0 h、48 h 细胞划痕宽度，计算细胞划痕愈合率。划痕愈合率＝（0 h 细胞划痕宽度-48 h划痕宽度）/0 h 细胞划痕宽度×100%。

1.11 肿瘤细胞成球试验

在各组细胞中加入成球培养基，在低黏附的6 孔板中培养10 d，在显微镜下随机选取5 个视野观察细胞成球情况并拍照，使用Image J 软件计数直径≥75 μm 的肿瘤球数量，并计算成球率。成球率＝肿瘤球数/接种细胞数×100%，肿瘤细胞成球率取5 个视野的平均值。

1.12 蛋白质印迹法检测组织和细胞中蛋白的表达情况

CRC 组织、癌旁组织和各组细胞使用RIPA裂解液提取总蛋白，使用BCA 法检测浓度。蛋白质变性后使用10% SDS-PAGE 分离总蛋白，转膜，5%脱脂牛奶封闭，加入β-Catenin、Axin1、c-Myc、CD133、CD44、SOX2 和β-actin 一抗，在4 ℃下孵育过夜，用HRP 偶联的二抗孵育2 h，洗涤，使用ECL 液显色，使用Image J 软件对蛋白条带灰度值进行定量分析。

1.13 裸鼠体内移植瘤实验

将18 只裸鼠随机分为对照组、si-NC 组和si-CDK5RAP1 组，每组6 只。分别向各组裸鼠右前肢腋下注射对应的HCT-116 细胞悬液，每只注射4×106个细胞，5 周后以颈椎脱臼法处死裸鼠，剥离肿瘤组织并称重观察。

1.14 统计学分析

应用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料以例（%）表示。2 组间数据比较采用SNK-q检验，多组间数据比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC 组织和癌旁组织中CDK5RAP1 的表达情况

实时荧光定量PCR 法检测结果显示，CRC 组织中CDK5RAP1 的表达水平较癌旁组织显著升高（P＜0.05）；免疫组织化学染色结果显示，CRC 组织中CDK5RAP1 阳性表达率较癌旁组织显著升高（P＜0.05）。见表2、图1。

表2 CRC 组织和癌旁组织中CDK5RAP1 的表达情况

2.2 各细胞中CDK5RAP1 的表达水平

如表3 所示，与NCM460 细胞相比，HCT-116、SW480、HT29、SW620、Caco-2 细胞中CDK5RAP1的表达水平均显著升高（P均＜0.05）， 并且CDK5RAP1 在HCT-116 细胞中表达水平最高，在SW480 细胞中表达水平最低，故分别采用HCT-116细胞和SW480 细胞构建CDK5RAP1 基因敲低和过表达的慢病毒载体稳定转染细胞株。

表3 各细胞中CDK5RAP1 的表达水平

2.3 各组CRC 细胞中CDK5RAP1 的表达水平

如表4 所示，SW480-pc-CDK5RAP1 组细胞中CDK5RAP1 的表达水平较SW480-CON 组和SW480-pc-NC 组细胞均显著升高（P均＜0.05），SW480-HLY78 组 与SW480-pc-CDK5RAP1 组 细 胞中CDK5RAP1 的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。如表5 所示，HCT-116-si-CDK5RAP1 组细胞中CDK5RAP1 的表达水平较HCT-116-CON 组和HCT-116-si-NC 组细胞均显著降低（P均＜0.05），HCT-116-HLY78 组与HCT-116-si-CDK5RAP1 组细胞中CDK5RAP1 的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组 SW480 细胞中CDK5RAP1 的表达水平

表5 各组HCT-116 细胞中CDK5RAP1 的表达水平

2.4 各组CRC 细胞的增殖和克隆情况

4SW480-pc-CDK5RAP1 组细胞存活率和克隆率较SW480-CON 组和SW480-pc-NC 组细胞均显著升高（P均＜0.05），SW480-HLY78 组细胞存活率和克隆率较SW480-pc-CDK5RAP1 组细胞均显著升高（P均＜0.05），见表6、图2。HCT-116-si-CDK5RAP1 组细胞存活率和克隆率较HCT-116-CON 组和HCT-116-si-NC 组细胞均显著降低（P均＜0.05），HCT-116-HLY78 组细胞存活率和克隆率较HCT-116-si-CDK5RAP1 组细胞均显著升高（P均＜0.05），见表7、图3。

图2 各组 SW480 细胞的克隆情况 A SW480-CON 组 B SW480-pc-NC 组 C SW480-pc-CDK5RAP1 组 D SW480-HLY78 组

图3 各组HCT-116 细胞的克隆情况 A HCT-116-CON 组 B HCT-116-si-NC 组 C HCT-116-si-CDK5RAP1 组 D HCT-116-HLY78 组

表6 各组 SW480 细胞的增殖和克隆情况

表7 各组HCT-116 细胞的增殖和克隆情况

2.5 各组CRC 细胞的迁移和侵袭情况

SW480-pc-CDK5RAP1 组的细胞划痕愈合率和细胞侵袭数量较SW480-CON 组和SW480-pc-NC 组均显著升高（P均＜0.05），SW480-HLY78 组的细胞划痕愈合率和细胞侵袭数量较SW480-pc-CDK5RAP1 组均显著升高（P均＜0.05），见表8、图4 和图5。HCT-116-si-CDK5RAP1 组的细胞划痕愈合率和细胞侵袭数量较HCT-116-CON 组和HCT-116-si-NC 组均显著降低（P均＜0.05），HCT-116-HLY78 组的细胞划痕愈合率和细胞侵袭数量较HCT-116-si-CDK5RAP1 组均显著升高（P均＜0.05），见表9、图6 和图7。

图4 各组SW480 细胞的迁移情况 ×100 A 迁移0 h B 迁移48 h

图5 各组SW480 细胞的侵袭情况 ×400 A SW480-CON 组 B SW480-pc-NC 组 C SW480-pc-CDK5RAP1 组 D SW480-HLY78 组

图6 各组HCT-116 细胞的迁移情况 ×100 A 迁移0 h B 迁移48 h

图7 各组HCT-116 细胞的侵袭情况 ×400 A HCT-116-CON 组 B HCT-116-si-NC 组 C HCT-116-si-CDK5RAP1 组 D HCT-116-HLY78 组

表8 各组SW480 细胞的迁移和侵袭情况

2.6 各组CRC 细胞的肿瘤球形成情况

SW480-pc-CDK5RAP1 组细胞的成球率较SW480-CON 组和SW480-pc-NC 组均显著升高（P均＜0.05），SW480-HLY78 组细胞的成球率较SW480-pc-CDK5RAP1 组显著升高（P＜0.05），见表10、图8。HCT-116-si-CDK5RAP1 组细胞的成球率较HCT-116-CON 组和HCT-116-si-NC 组均显著降低（P均＜0.05），HCT-116-HLY78 组细胞的成球率较HCT-116-si-CDK5RAP1 组显著升高（P＜0.05），见表11、图9。

图8 各组SW480 细胞的肿瘤球形成情况 ×100 A SW480-CON 组 B SW480-pc-NC 组 C SW480-pc-CDK5RAP1 组 D SW480-HLY78 组

图9 各组HCT-116 细胞的肿瘤球形成情况 ×100 A HCT-116-CON 组 B HCT-116-si-NC 组 C HCT-116-si-CDK5RAP1 组D HCT-116-HLY78 组

表10 各组SW480 细胞的肿瘤球形成情况

表11 各组HCT-116 细胞的肿瘤球形成情况

2.7 各组CRC 细胞中蛋白的表达水平

与SW480-CON 组和SW480-pc-NC 组相比，SW480-pc-CDK5RAP1 组细胞中β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2 蛋白的表达水平均显著升高，Axin1 蛋白的表达水平显著降低（P均＜0.05）；与SW480-pc-CDK5RAP1 组相比，SW480-HLY78 组细 胞 中β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2蛋白表达水平均显著升高，Axin1 蛋白表达水平显著降低（P均＜0.05）；见表12、图10。与HCT-116-CON 组 和HCT-116-si-NC 组 比，HCT-116-si-CDK5RAP1 组细胞中β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2 蛋白表达水平均显著降低，Axin1 蛋白表达水平显著升高（P均＜0.05）；与HCT-116-si-CDK5RAP1 组相比，HCT-116-HLY78 组细胞中β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2 蛋白表达水平均显著升高，Axin1 蛋白表达水平显著降低（P均＜0.05）；见表13、图11。

图10 各组SW480 细胞中蛋白表达水平

图11 各组HCT-116 细胞中蛋白表达水平

表12 各组SW480 细胞中蛋白的表达水平

表13 各组HCT-116 细胞中蛋白的表达水平

2.8 敲低CDK5RAP1 基因表达对裸鼠移植瘤的影响

如表14、图12 所示，si-CDK5RAP1 组裸鼠移植瘤的质量较CON 组和si-NC 组均显著降低（P均＜0.05），体积也均显著缩小。

图12 各组裸鼠移植瘤的体积

表14 各组裸鼠移植瘤的质量

3 讨论

CRC 是全球常见消化道恶性肿瘤之一，尽管临床诊断和综合治疗显著延长了部分患者的生存期，但CRC 转移患者的预后仍较差[7-8]。目前靶向治疗已成为CRC 转移患者的治疗方法之一，寻找新的靶点对于改善CRC 患者的治疗结果非常重要。CDK5 是一种脯氨酸介导的丝氨酸/苏氨酸激酶，研究发现CDK5 在胃癌组织中表达下调，而CDK5 表达上调则可抑制胃癌发生[9]。此外，许多研究报道CDK5 还与前列腺癌、甲状腺髓样癌、肝细胞癌、肺癌及CRC 均有相关性[10]。CDK5RAP1是CDK5 的内源性抑制剂，CDK5RAP1 过表达可显著抑制CDK5 的活性[11]。Yamamoto 等[12]的研究发现，DK5RAP1 可以维持胶质瘤起始细胞（GIC）的自我更新能力、未分化状态及致瘤潜力。本研究结果显示，CRC 组织中CDK5RAP1 的表达水平较癌旁组织显著升高，各CRC 细胞中CDK5RAP1 的表达水平也均显著高于正常结直肠上皮细胞，且CDK5RAP1 在HCT-116 细胞中表达水平最高，在SW480 细胞中表达水平最低，表明CDK5RAP1在CRC 组织和细胞中呈高表达。为进一步探索CDK5RAP1 在CRC 中的作用，本研究选用HCT-116细胞和SW480 细胞分别构建了CDK5RAP1 基因敲低和过表达的慢病毒载体稳定转染细胞株，结果显示CDK5RAP1 基因过表达时，SW480 细胞的存活率、细胞克隆率、细胞划痕愈合率及细胞侵袭数量均显著升高；CDK5RAP1 基因敲低时，HCT-116 细胞的存活率、细胞克隆率、细胞划痕愈合率及细胞侵袭数量均显著降低，表明CDK5RAP1 在CRC 中起着促癌作用，CDK5RAP1 表达下调可抑制CRC的发生和进展。为了探索CDK5RAP1 在机体内的作用，本研究将稳定转染的HCT-116 细胞皮下注射到裸鼠体内，5 周后发现CDK5RAP1 低表达的si-CDK5RAP1 组裸鼠的移植瘤质量明显低于CON 组，表明CDK5RAP1 参与了裸鼠体内CRC 的发生。

Wnt/β-Catenin 信号通路与细胞的增殖、分化、迁移和存活相关[13]。该信号通路异常激活是CRC发生和进展的关键驱动因素，可促进肿瘤的生长和复发[14]。β-Catenin 是Wnt/β-Catenin 通路的关键调控因子，β-Catenin 进入细胞核与转录因子（TCF）结合，激活下游基因（CD44 和c-Myc）的转录，从而增强CRC 的干性并促进CRC 进展[15]。Axin1 是Wnt/β-Catenin 信号通路的重要负向调节剂，Axin1低表达会导致β-Catenin 和下游癌基因过度转录，从而促使肿瘤发生。多种肿瘤中存在Axin1 表达下调，如肝细胞癌、结直肠癌、前列腺癌和胃癌，诱导Axin1 表达上调是Wnt/β-Catenin 信号通路依赖性肿瘤的新疗法[16-18]。CD133 和CD44 是人CRC 干细胞的重要标志物，CD133 是肿瘤干细胞上表达的五跨膜糖蛋白，CD44 参与肿瘤细胞的增殖、黏附和迁移[19]。SOX2 可驱动肿瘤干细胞的特性，促进肿瘤发生和侵袭，Jiang 等[20]的研究发现miR-30-5p 过表达可显著降低HEK293 和Caco2 细胞的CD133 和SOX2 表达，并可降低CRC 干细胞中Wnt/β-Catenin信号转导靶基因（Axin2 和Myc）的表达水平。本研究也发现CDK5RAP1 高表达可使SW480 细胞的成球率及β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2的蛋白表达水平升高，并可使Axin1 的蛋白表达水平降低，而敲低CDK5RAP1 表达则可使HCT-116细胞的成球率及β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2 的蛋白表达水平降低，并可使Axin1 的蛋白表达水平升高，该结果表明CDK5RAP1 可调节细胞的干性，并提示CDK5RAP1 可通过调控Wnt/β-Catenin 信号通路参与CRC 的发生。本研究还发现加入Wnt 激活剂HLY78 后，HLY78 可进一步促进CDK5RAP1 高表达的SW80 细胞的增殖、迁移、侵袭及干性，也可逆转CDK5RAP1 低表达对HCT-116 细胞增殖、迁移、侵袭和干性的抑制，进一步验证了CDK5RAP1 可靶向Wnt/β-Catenin 信号通路参与CRC 的发生和进展。

综上所述，CDK5RAP1 在CRC 中呈高表达，可促进CRC 细胞的增殖、迁移、侵袭和干性，而敲低CDK5RAP1 表达可通过Wnt/β-Catenin 信号通路抑制CRC 细胞的增殖、迁移、侵袭和干性。目前CDK5RAP1 靶向Wnt/β-Catenin 信号通路的直接作用靶点尚未明确，今后的研究将对此进行深入探索，为CDK5RAP1 在CRC 的临床靶向治疗提供理论依据。