一种含吗啉修饰的多吡啶钯(Ⅱ)配合物的合成、表征与抗金黄色葡萄球菌作用研究

王润宾,韩天植,李知敏,尧智玲,廖向文,王金涛

(江西科技师范大学药学院,南昌 330013)

0 引 言

金黄色葡萄球菌是一种常见的可引起感染的细菌[1],应对金黄色葡萄球菌感染的问题一直是全球致力关注和解决的焦点。尽管抗生素对应对细菌感染有着极大的作用和显著的效果,但是近年来由于抗生素的不当使用和误用,导致细菌产生抗药性,使得多重耐药金黄色葡萄球菌的出现再度成为严重的临床问题[2]。据估计,到2050年由于感染耐药菌死亡的人数可能达到1 000万人[3]。因而研究人员需要开始一些新的途径和方法来寻找替代抗生素的抗菌药物。

近年来,金属配合物在抗菌和抗癌等方面的良好表现,引起了药物化学家的广泛关注[4],比如镓配合物对一些产生多重耐药性的阴性菌种,如鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌,具有很强的敏感性,推测镓配合物可能有多重靶点[5-8]。而一些金属铜配合物也具有良好的抗菌活性,如金属铜和骆驼宁碱形成的金属铜配合物,它对铜绿假单胞菌的抑制圈直径为8～19 mm,优于标准的抗菌药阿莫西林[9-10]。另外钌的多吡啶配合物在抗菌等活性上似乎表现出良好的发展潜力,本课题组也一直致力于开发具有优良抗菌活性的多吡啶金属配合物,例如发现[Ru(dmb)2(ETPIP)](ClO4)2(Ru(Ⅱ)-1)和[Ru(phen)2(ETPIP)](ClO4)2(Ru(Ⅱ)-2)两种钌配合物对金黄色葡萄球菌有良好的抗菌活性(最小抑菌浓度MIC值分别为0.05 mg/mL, 0.025 mg/mL),而且金黄色葡萄球菌几乎对其不产生耐药性,更为重要的是,发现Ru(Ⅱ)-2配合物可以抑制代谢控制蛋白A的活性,从而导致细菌的死亡[11]。具有多种不同结构和功能的多吡啶钌配合物可以和生物分子相互作用,其与长期使用的有机抗生素相比可能表现出不同的作用机制[12],这对于应对细菌耐药来说具有很重要的意义。钌配合物取得的诸多进展,对研究其他种类的金属配合物带来启发,例如:一些钯配合物不仅对革兰氏阳性菌菌株表现出了良好的抗菌活性,还对阴性菌有良好的活性,比如含N-杂环卡宾的钯配合物对革兰氏阳性菌中的藤黄微球菌和革兰氏阴性菌中的李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌有中等的抗菌效果(MIC值分别为0.019 7～0.062 5、0.078～1.25和1.25～5 mg/mL)[13]。钯和钌处于同一族,是否钯也同样具有优异的抗菌潜力有待进一步挖掘,而关于钯配合物抗菌方面的研究相对较少。基于此,本文设计合成了一种含有吗啉基团修饰的三联吡啶衍生配体及其配合物Pd1(见图1),引入吗啉作为功能基团是由于它是一种具有良好的理化、生物和代谢特性的杂环化合物,适当修饰的吗啉具有广泛的生物作用,从镇痛、抗炎、抗氧化、抗肥胖、抗高血脂症,到抗菌、抗神经退行性和抗癌活性等[14-17]。本团队前期研究发现基于此配体的铂类配合物展现出良好的抗肿瘤效果,特别是对耐顺铂细胞株同样展现出了较好的活性抑制能力[18]。在合成及充分表征此例新结构基础上,评估Pd1对金黄色葡萄球菌的抗菌活性及抑制生物膜的活性。考虑一些致病菌对常见抗生素耐受性的产生,本文通过棋盘法测定Pd1是否可以作为抑制致病菌对常见抗生素耐药性产生的抗菌辅助剂,此外还测定了Pd1清除细菌分泌毒素的活性。

图1 钯配合物的合成路线Fig.1 Synthetic route of Pd(Ⅱ) complex

1 实 验

1.1 试剂与仪器

图1中配体4′-[4-(4-吗啉基丁氧基)苯基]-2,2′∶6′2″-三联吡啶根据文献方法[19]合成,其他试剂、药品均为市售分析纯。

本研究所用仪器为:X射线单晶衍射仪(Bruker D8 VENTURE型),恒温培养箱和恒温培养摇床(Yiheng Scientific Instruments),酶标仪(BioTek Instruments),高分辨质谱仪(Waters Xevo G2-XS Q-TOF instrument),核磁共振仪(Bruker AVANCE 400 spectrometer)。

1.2 最小抑菌浓度(MIC)测定

测定Pd1对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。金黄色葡萄球菌在TSB培养基中培养过夜,然后用新鲜的培养基对培养过夜的菌液稀释1 000倍,将50 μL不同浓度的Pd1和200 μL加入过夜培养菌液后的培养基混合加入96孔板中,在37 ℃下培养20 h后观察分析结果。

1.3 生长曲线测定

使用酶标仪(800TS)测定Pd1对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。金黄色葡萄球菌在培养基中培养过夜。过夜菌液稀释100倍,加入到24孔的平板中,在摇菌床中以220 r/min的速度培养,用酶标仪每小时测定一次菌液的OD595 nm值。

1.4 耐药性实验

确定Pd1具有良好的抗菌活性之后,进一步评估金黄色葡萄球菌随着时间的变化是否会对Pd1产生耐药性。根据文献所提出的耐药性实验步骤[20],对其进行耐药实验,首先,对含有单一金黄色葡萄球菌的培养基培养过夜,取过夜菌10 μL然后用新的培养基对它稀释1 000倍。向96平板加入不同浓度Pd1的含菌培养基,在37 ℃的培养箱里培养20 h,取测定值为0.5倍MIC所对应的孔中的菌液5 μL,加入无菌的培养基稀释1 000倍,然后重复此操作传代至20代,观察第20代与第1代相比MIC值的倍数变化,同时采用阿米卡星作为对照。

1.5 生物膜形成的抑制

使用24孔板对Pd1进行生物膜实验。金黄色葡萄球菌在TSB培养基里培养过夜,然后用新鲜的培养基对过夜培养的菌液稀释1 000倍,再在24孔板中加入不同浓度含Pd1的培养基,24孔的平板在37 ℃下培养48 h,用无菌水洗去没有黏附的细菌三次,在室温下过夜晾干。

1.6 溶血实验

金黄色葡萄球菌在培养基中培养过夜,将过夜菌稀释100倍,5 mL不同浓度的含Pd1的稀释菌液的培养基,在摇菌床中以220 r/min的速度培养13 h,测定菌液的OD值,菌液在7 000 r/min的转速下离心,吸取菌液上清液。在EP管中加入25 μL的菌液、100 μL洗净的兔红细胞和1 mL的磷酸缓冲盐(phosphate buffered saline, PBS)溶液。在37 ℃下培养30 min,用离心机在2 000 r/min的速度下离心。测定离心后的混合液上清液OD543 nm的值。

1.7 联用实验

通过棋盘法测定抗生素和Pd1之间的协同作用。金黄色葡萄球菌在培养基中培养过夜。将过夜菌液稀释100倍,200 μL的含有稀释菌液的培养基、25 μLPd1和25 μL抗生素以梯度稀释的浓度加入到96孔的平板中,96孔的平板在37 ℃条件下培养20 h。

1.8 合成与表征

根据类似三联吡啶钯(Ⅱ)配合物合成的文献报道[19],取4′-[4-(4-吗啉基丁氧基)苯基)]-2,2′∶6′,2″-三联吡啶[18](46.6 g,0.1 mmol),醋酸钯(22.4 mg,0.1 mmol)和四丁基氯化铵(206 mg,0.7 mmol)至20 mL的圆底烧瓶中,加入7 mL乙腈,室温下反应24 h得到绿色沉淀。反应结束后,通过旋转蒸发仪除去乙腈,出现黏稠状液体,加入10 mL甲基叔丁基醚后出现沉淀,将此沉淀离心,真空干燥,得到绿色配合物(Pd1)151 mg,产率80.1%。1H NMR (400 Hz, DMSO) δ 8.88-8.74(m, 4H), 8.56(d,J=5.3 Hz, 2H),8.41(d, J=7.1 Hz, 2H),8.13(d, J=8.0 Hz, 2H),7.8(d, J=6.1 Hz, 2H),7.15(d, J=8.3 Hz, 2H),4.14(s, 2H),3.59(s, 4H),3.5(s, 2H),2.39(s, 4H),1.81(s, 2H),1.63(s, 2H)。高分辨质谱(HRMS,乙腈),测试值m/z: 607.109 1,[Pd1-Cl]+(理论值607.109 2)。元素分析按C29H30ClN4O2Pd计算值(%): C 54.09, H 4.70, N 8.70; 测试值(%): C 53.84, H 4.86, N 8.61。通过甲醇挥发可得黄色晶体。通过X射线单晶衍射仪在液氮低温条件下收集了配合物Pd1(0.19 mm×0.15 mm×0.04 mm)衍射数据,仪器配置单色石墨Mo Ka辐射衍射仪(λ=0.071 073 nm)。全部结构分析工作在SHELX2015程序完成[21]。化合物的主要晶体学数据列于表1。CCDC:2106064。

表1 Pd1的晶体和结构解析数据Table 1 Crystal and structure refinement data for Pd1

2 结果与讨论

2.1 合成与表征

配合物的合成路线方案都通过图1所示的步骤,并通过氢谱、碳谱、元素分析及高分辨质谱进行表征。用于X射线衍射晶体研究的Pd1通过甲醇挥发得到,具体的晶体结构如图2所示,Pd1属于单斜晶系,P21/n空间群,晶体衍射的数据收集见表1。

图2 Pd1的晶体结构图。(a)Pd1在三维分子结构下的热椭球图(30%的椭球率,省略氯离子和氢原子);(b)Pd1结构中分子的π-π堆积Fig.2 Crystal structure of Pd1. (a) Thermal ellipsoid plot of Pd1 in ORTEP view. Solvent molecules, counteranion Cl- and hydrogen atoms have been omitted for clarity; (b) intramolecular π-π stacking interactions in Pd1

图2晶体结构表明,配合物Pd1是经典的四配位钯配合物,其中钯与螯合三联吡啶配体的三个氮原子和一个氯原子结合,呈现出常见的四配位结构。如表2所示,在配合物Pd1中,四个配位键的键长分别是Pd1—Cl1为0.228 6(10) nm,Pd1-N1为0.203 6(3) nm,Pd1—N2为0.192 2(3) nm,Pd1—N3为0.202 7(3) nm,键角分别是N1—Pd1—Cl1为100.01(9)°,N2—Pd1—N1为80.77(11)°,N2—Pd1—N3为81.03(11)°,N3—Pd1—Cl1为98.16(9)°,总和为359.87°,接近360°,呈现出良好的平面几何构型。同时,每个配合物分子附近有三个甲醇分子。在空间结构上,两个分子头尾相间,局部趋于平行,分子之间近似环中心之间的距离为0.361 5和0.391 6 nm(见图2(b)),表明分子之间存在π-π弱堆积作用。

表2 Pd1的主要键长和键角Table 2 Selected bond lengths and angles for Pd1

2.2 Pd1对金黄色葡萄球菌的抗菌活性

首先,为了测定引入吗啉修饰基团的Pd1对金黄色葡萄球菌的抗菌活性,通过最小抑菌浓度MIC对Pd1进行评估,得到的MIC值为62.48 μg/mL,由此可以看出,在引入含吗啉修饰的基团后形成的Pd1具有良好的抗菌活性。随后,通过绘制生长曲线(见图3),可以看出Pd1对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,在MIC下金黄色葡萄球菌的生长明显被抑制,此抑制活性呈现浓度依赖效应,在低浓度下(0.5倍MIC),细菌的生长受到明显抑制。

图3 Pd1在不同的浓度下对金黄色葡萄球菌的生长的抑制作用Fig.3 Inhibition effect of Pd1 on the growth of S.aureus with different concentration

2.3 Pd1的耐药实验

细菌容易产生耐药性是抗菌药物的研发过程中面临一项严峻的挑战。为了进一步评估金黄色葡萄球菌在Pd1处理条件下是否容易对Pd1产生耐药性,本文进行了耐药实验。所得实验结果如图4所示,发现Pd1在重复传代20次培养之后,MIC值只增长了1倍,然而对照的抗生素阿米卡星则是增长了64倍。此结果表明Pd1不容易使金黄色葡萄球菌产生耐药性,而且它的效果显著。通常,化合物可能对一些与产生耐药性有关的物质有着显著影响,而生物膜作为产生耐药性的重要物质,可能是其作用靶点之一。

图4 金黄色葡萄球菌对Pd1和抗生素阿米卡星的耐受性变化,数值变化是每代最小抑菌浓度值除以第一代最小抑菌浓度值的倍数Fig.4 Resistance development of S. aureus to Pd1 and the antibiotics amikacin. Values are fold change of the MIC of each generation divided by the MIC of first generation

2.4 Pd1对易引发耐药性的生物膜形成的抑制

生物膜是一种自我产生的将细菌菌落包含在细胞外基质的聚合物质,它黏附在生物或非生物的表面[22]。为了进一步探究Pd1是否能够抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成,通过对金黄色葡萄球菌表现出良好抑菌活性的Pd1来测定其对生物膜形成的影响,并通过结晶紫染色来对生物膜进行初步定量。如图5所示,金黄色葡萄球菌在浓度为0.25倍MIC、0.5倍MIC的Pd1的培养基中培养48 h,生物膜的形成分别减少了48.7%、74.1%,这可以看出Pd1对生物膜形成的抑制是非常明显的。生物膜的形成与细菌产生耐药性密切相关,而通过耐药性实验,已经得出金黄色葡萄球菌不容易对Pd1产生耐药性,这表明Pd1可以通过抑制生物膜的形成很好地阻止细菌耐药性的发生,这对于开发新型抗菌药物是非常重要的。另外值得说明的是,用于生物膜分析测定的浓度(0.25倍MIC、0.5倍MIC)对于金黄色葡萄球菌来说都是抑制性而非致死性的,都不足以杀死金黄色葡萄球菌。

图5 Pd1分别在0、15.62和31.24 μg/mL的浓度下对金黄色葡萄球菌的生物膜形成的影响(该实验对三个平行对照组进行测定)。(a)在24孔板中用结晶紫染色后并用50%的冰醋酸溶解后的生物膜;(b)Pd1在0、15.62和31.24 μg/mL的浓度下对生物膜形成抑制的数据趋势图Fig.5 Effect on biofilm formation of S. aureus strains with 0, 15.62 and 31.24 μg/mL of Pd1 (this experiment were investigated with three biological replicates). (a) The biofilm stained by crystal violet and dissolved with 50% of glacial acetic acid in 24-well plate; (b) the data trend graph reflected that Pd1 inhibit the formation of biofilm at different concentration of 0, 15.62 and 31.24 μg/mL

2.5 Pd1对金黄色葡萄球菌毒素的抑制

细菌毒素在细菌感染中发挥非常重要的作用,它可以通过一定的生物机制引起细胞不同形态和生理学上的变化从而导致细胞的死亡[23]。为了研究Pd1清除细菌毒素的抗菌活性,通过测定OD543 nm处的吸光度值来测定红细胞破裂的程度。如图6所示,红细胞在浓度为0.25倍MIC及0.5倍MIC时,它的破损分别减少18.5%、63.7%,由此可以看出Pd1清除金黄色葡萄球菌毒素或抑制其分泌毒素的活性显著。而细菌发挥它的毒害作用,主要是通过产生毒素,Pd1对金黄色葡萄球菌产生毒素的抑制可以阻止它对感染者造成进一步的损害。

图6 Pd1在0、15.62和31.24 μg/mL的浓度下对金黄色葡萄球菌毒素的作用(该实验对三个平行对照组进行测定)。(a)在ep管中受毒素影响兔血红细胞的破裂程度;(b)Pd1在0、15.62和31.24 μg/mL的浓度下对毒素形成抑制的数据趋势图Fig.6 Effect on toxins against S. aureus with 0, 15.62 and 31.24 μg/mL Pd1 from left to right (this experiment were investigated with three biological replicates). (a) The degree of red blood cell rupture influenced by toxin in eppendorf tube; (b) the data trend graph reflected that Pd1 inhibit the formation of toxins at different concentration of 0, 15.62 and 31.24 μg/mL

2.6 Pd1与抗生素的联用

为了克服耐药性,包括抗菌辅助剂在内的许多方法策略被研究人员采用,许多阻止细菌对现有抗生素产生耐受性的分子可以增加细菌对金黄色葡萄球菌的敏感性。因此采用棋盘法[24]来测定Pd1和许多种来自不同类别的抗生素之间是否有联用效果。包括盐酸克林霉素、氨苄青霉素、氧氟沙星和阿奇霉素。金黄色葡萄球菌加入到新的培养基培养过夜,然后将过夜培养的菌液用新鲜的培养基稀释,加入到96孔板的孔中,并按照梯度稀释的方式用DMSO溶解Pd1以及选择好的常见抗生素。96平板在37 ℃下培养过夜。部分抑菌浓度指数FICI(fractional inhibition concentration indices)定义为每个药联合使用得到的MIC除以每个药分开使用得到的MIC之和。当FICI≥4时,两者体现为拮抗作用,当FICI<0.5时,两者体现为协同作用。棋盘法评估和结果如表3所示。通过测定发现盐酸克林霉素和Pd1的FICI的值为0.375,因此两者具有协同作用,Pd1可以增强盐酸克林霉素对金黄色葡萄球菌的敏感性(其他几种抗生素FICI的值均大于0.5,表现出无协同作用)。目前,研究发现了一部分抗生素作用于细菌的靶点,Pd1和盐酸克林霉素之间的联合作用增强了金黄色葡萄球菌对盐酸克林霉素的敏感性,这一结果可以用来进一步研究Pd1和盐酸克林霉素的作用靶点及作用机制之间的关联。

表3 抗生素和Pd1联合使用的不同抗生素的最小抑菌浓度和部分抑制浓度指数Table 3 MIC and FICI of different antibiotics used in combination with Pd1

3 结 论

本文合成了含吗啉修饰基团的三联吡啶钯配合物(Pd1),它显示出了对金黄色葡萄球菌的良好抗菌活性(MIC=62.48 μg/mL),生长曲线呈现明显的浓度依赖,当Pd1浓度为MIC时,金黄色葡萄球菌的生长几乎被完全抑制。更重要的是,金黄色葡萄球菌对Pd1几乎不产生耐药性,这可能意味着其作用于细菌的时间短、效力强。此外,还发现Pd1对抑制生物膜的生长和细菌毒素的分泌有显著的效果,这为研究人员寻找和设计Pd1的抗菌机制提供了重要的参考。总之,Pd1表现出的优良抗菌活性表明其在抗菌方面具有极大的应用潜力,值得进一步挖掘和探索。