应用全外显子测序技术筛查LEOPARD综合征患者致病基因一例

鲁巧云 姜北雪 王 充 阳 芳

1湖北文理学院附属医院,襄阳市中心医院皮肤科, 湖北襄阳,441021;2深圳市人民医院(暨南大学第二临床医学院,南方科技大学第一附属医院)皮肤科,广东深圳,518020;3国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心分中心建设单位,广东深圳,518020

LEOPARD综合征(LEOPARD syndrome,LS)是一种罕见的常染色体显性遗传疾病,属于神经-心-面-皮肤综合征(neuro-cardio-facio-cutaneous syndromes, NCFCs)家族,该家族包括神经纤维瘤病-1(NF1)、Noonan综合征(NS)、Costello综合征(CS)、心-面-皮肤综合征、毛发生长初期毛发松散的Noonan样综合征和Legius综合症。这些疾病由编码RAS-MAPK 细胞通路的蛋白质的基因突变引起。不同综合征的临床异质性和表型具有重叠性。LS表现出多发性黑子和先天性异常症状如眼距过宽、生殖器畸形、发育迟缓、耳聋等特征［1］。LS最常由蛋白酪氨酸磷酸酶非受体11型(PTPN11)基因突变导致［2］,我们报道了1例临床诊断为LS的男性患者,经基因检测确定了PTPN11基因12号外显子存在c.1415C>T(p.Thr472Met)的杂合突变。

1 资料和方法

1.1 临床资料 患者,男,30岁。因全身黑褐色斑疹26年就诊。患者26年前开始出现全身黑褐色斑疹,无明显不适症状,曾至外院皮肤科就诊,诊断为“泛发性黑子”,未予治疗。12年前曾因“漏斗胸”于我院住院行胸腔镜Nuss漏斗胸矫正术治疗。患者2021年诊断出甲状腺癌,肿瘤检测出基因BRAF V600E突变。家族中无类似疾病,父母非近亲结婚,母亲因肺癌去世。体检:发育、听力正常,心率齐,未闻及明显病理性杂音,其余系统检测无明显异常。皮肤科情况:面部、躯干及四肢泛发直径1～10 mm褐色至黑色斑疹、斑片,躯干、四肢可见数处大小不等、形状不规则褐色斑疹,边界清楚(图1)。实验室检查示血、尿常规、生化、出凝血时间均无异常。

图1 LEOPARD综合征患者临床表现:面部,躯干,四肢广泛分布的泛发性黑子

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集 经知情同意后,用EDTA抗凝管分别采集患者及其父外周血4 mL,-70℃保存。

1.2.2 全外显子组高通量测序 简要实验流程及方法如下:(1)应用试剂盒提取外周血DNA,经紫外分光光度仪器进行纯度及浓度检测,符合全外显子组高通量测序质检要求。(2)将基因组DNA打断后制备文库。外显子捕获下来,经PCR线性扩增后进行文库质检,合格即可进行测序。进行Illumina HiSeq4000 PE150测序。(3)对检测到的变异进行注释,注释数据库主要包括i)人口数据库,如gnomAD (http://gnomad.broadinstitute.org/)、1000基因组计划(http://browser.1000genomes.org)、Berrybig data人口数据库、dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)等; ii)预测算法方面,如SIFT (http://sift.jcvi.org)、FATHMM (http://fathmm.biocompute.org.uk)、MutationAssesso r(http://mutationassessor.org)、CADD (http://cadd.gs.washington.edu)、SPIDEX(Xiong et al, Science 2015)等; iii)疾病和表型数据库,如OMIM (http://www.omim.org)、ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)、HGMD (http://www.hgmd.org)、HPO (https://hpo.jax.org/app/)等。

1.2.3 Sanger测序验证 根据需要测序的DNA片段合成引物,用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法进行扩增,用ABI3730xl测序仪(美国Applied Biosystems公司)以Sanger测序法进行测序,测序结果采用Snap Gene Viewer软件与Ensemble网站公布的DNA序列对比。

2 结果

全外显子组高通量测序结果显示:患者的PTPN11基因12号外显子第1415位核苷酸发生c.1415C>T(NM _001330437.2,对应GRCh37参考基因组物理位置:Chr12:112629270),导致第472号氨基酸由Thr变为Met(p.Thr472Met),患者父亲无异常(图2)。该突变位点多次被报道导致LS,是最常见的突变位点,致病性评级为“致病性”。

图2 Sanger测序验证结果

3 讨论

LEOPARD综合征是一种罕见的常染色体显性遗传病,Zeisler和Becker在1936年第一次报道了本病,随后Gorlin等在1969年根据其典型临床表现的首字母缩写命名,系多发性黑子(lentigines)、心电图异常(electrocardiographic conduction defects)、眼距过宽(ocular hypertelorism)、肺动脉瓣狭窄(pulmonary valve stenosis)、生殖器畸形(abnormalities of genitalia)、发育迟缓(retardation of growth)和耳聋(deafness)［1］。作为神经-心-面-皮肤综合征(NCFCs)的一种,这类疾病表现出显著的遗传和表型异质性:同一基因的突变可能导致不同的综合征,如PTPN11基因突变可导致Noonan综合征和LS;另,RAS/MAPK 级联不同水平的不同蛋白的功能障碍可导致类似的临床表现。LS临床表现与Noonan综合征有重叠性,LS又常被称作Noonan综合征伴多发性黑子,临床表型变异度很大［2］,LS被认为是NS的一个变异型［3］。

LS皮损的典型表现为多发的扁平黑褐色斑点,好发于面颈部和躯干上部,一般不累及黏膜,皮疹通常在患儿4～5岁时出现,青春期数量可增加到数千个。70%～80%的LS患者皮肤有咖啡斑的表现,皮损通常在患儿出生后数月内出现,常早于黑子出现［4］。少数人可出现局部色素减退斑及甲营养不良。其他临床表现包括颅面畸形(上睑下垂、外眦低于内眦、低位或后旋耳、宽鼻根等),眼部疾病(高度远视),心血管系统疾病(肥厚性心肌病、肺动脉狭窄、二尖瓣关闭不全等),骨骼疾病(漏斗胸、鸡胸、肘骨外翻、脊椎畸形等)及血液系统疾病(血小板减少症、白血病)等。目前LS的诊断标准,患者有多个雀斑样痣加上2个其他主要特征,即可诊断为LS［4,5］。本例患者有全身多发黑子及咖啡斑、漏斗胸及眼距增宽的临床特征,临床表现符合LS的诊断,分子诊断证实了该患者的诊断。

PTPN11、RAF1和BRAF是已知与 LS 相关的基因。85%的LS患者与PTPN11基因突变相关,其他致病基因有RAF1、BRAF和MAP2K1［2］,PTPN11基因通过编码蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP-2)来调节RAS信号通路,SHP-2是各种生长因子、细胞因子、激素和整合素的细胞质传感器,从而最终产生LS的各种临床表型。在一项对9例LS和2例伴有咖啡斑和PTPN11基因突变的NS患者的研究中,发现11例患者中有10例检测出PTPN11基因7号或12号外显子发生错义突变,这两种突变影响了PTPN11基因磷酸酪氨酸磷酸酶结构域。有研究者提出LS和NS是等位基因疾病,独特的分子和致病机制导致了NS的亚型LS具有特有的皮肤表现［6］。PTPN11基因突变会导致RAS/MAPK传导通路发生改变,该信号传导通路在各种癌症的发生过程中起着关键作用,还会增加白血病、神经母细胞瘤及黑素细胞瘤等恶性肿瘤疾病的风险［7］。本例患者合并甲状腺癌,肿瘤检测出BRAF基因V600E突变,考虑PTPN11种系突变合并BRAF体系突变。BRAF基因广泛表达,编码属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 RAF/mil 家族的蛋白(BRAF 蛋白),该蛋白在GTP结合的RAS结合后被激活并磷酸化,并激活丝裂原激活的蛋白激酶激酶MEK1和MEK2。因此,该蛋白在调节MAP激酶/ERK信号通路中发挥作用,从而影响细胞分裂、分化和分泌。BRAF体细胞突变与多种癌症相关,包括非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、非小细胞肺癌和肺腺癌。

目前,已经发现可导致LS的PTPN11基因的致病突变位点超过20个,包括Tyr279Cys/Ser、Ala461Thr/Ser、Gly464Ala、Thr468Met/Pro、Arg498Leu/Trp、Gln506Pro及Gln510Glu/Pro［8-10］。85%的LS为7、12和13号外显子发生突变,其中7号外显子p.Tyr279Cys和12号外显子p.Thr468Met错义突变的比例占65%。本例患者PTPN11基因12号外显子c.1415C>T(p.Thr472Met)杂合错义突变,该位点和c.1403C>T(p.Thr468Met) 文献实际为同一位点,即SNP数据库中的rs121918457,已被报道导致LS。PTPN11基因突变位点的不同导致具有不同临床表型的等位基因疾病,这些突变会增加患癌症的风险［11］。LS中矮小、耳聋和肥厚性心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)与p.Tyr279Cys突变有关,虽然HCM不在LEOPARD缩写中,但它是LS最常出现的一种心脏疾病,p.Tyr279Cys突变导致SHP-2失去催化活性,还可以使PI3K/AKT/mTOR通路过度激活,此通路过度激活与LS相关的HCM发病密切相关,p.Tyr279Cys对Ras/MAPK(激活或抑制)的影响仍存在争议［2,12］。Thr468Met突变在LS预后中似乎是一种保护因素,而非Thr468Met突变与猝死、短阵室速、室上速 、梗阻性心肌病等心血管不良事件相关,有致死风险患者皆为非Thr468Met突变患者［13］。本例患者目前无心脏及肿瘤相关疾病表现,但需要对患者进行长期随访,定期筛查肿瘤疾病及心脏评估。

皮肤多发性黑子影响患者的美观,是大多数LS患者主要关注的问题,如果皮损长时间受到创伤或外界刺激,可考虑手术、冷冻或激光去除,Kontoes等［14］报道了强脉冲光成功治疗LS的案例,Nuha Alfurayh通过翠绿石激光治疗且获得了满意的疗效［2］,可尝试使用该方法治疗。