E-钙黏蛋白和β-连环蛋白在乳房外Paget病中的表达

柴圆圆 严 翘 董正邦 王飞

1苏州大学附属儿童医院皮肤科,江苏苏州,215000;2东南大学附属中大医院皮肤科,江苏南京,210000

乳房外Paget病(extramammary Paget’s disease, EMPD)是一种少见的特殊类型皮肤恶性肿瘤,占外阴肿瘤的1%～2%,好发于顶泌汗腺丰富的部位,外阴与阴囊是最常见的好发部位［1］。肿瘤的侵袭与转移决定了肿瘤的预后,是恶性肿瘤最显著的生物学特性之一。虽然EMPD恶性程度较低,但是作为一种肿瘤组织,同样具有侵袭和转移的能力［2］。免疫组化在肿瘤的治疗及预后中起着重要的指导作用,因此寻找肿瘤的特异性免疫标志物一直是临床热点问题。

上皮细胞间质化(EMT)是一种从有极性的不能移动的上皮细胞转化为间质细胞的改变,导致细胞移动能力的增加,在肿瘤发生侵袭、转移的过程中发挥重要的作用［3,4］, E-钙黏蛋白与β-连环蛋白都是EMT机制中重要的分子,介导着细胞间黏附作用［3］。目前在多个研究中,E-钙黏蛋白与β-连环蛋白被发现其表达高低与甲状腺癌、食管癌、皮肤鳞状细胞癌及膀胱癌的侵袭转移相关［5,6］,但是关于两者在乳房外Paget病中的表达情况及预后的关系鲜有报道。

本研究收集33例原发性EMPD患者及25例正常包皮组织,旨在检测E-钙黏蛋白及β-连环蛋白在乳房外Paget病中的表达情况,分析其在EMPD肿瘤侵袭及转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 实验组资料来自2010年1月至2018年10月期间在东南大学附属中大医院、南京市鼓楼医院和无锡锡山人民医院经病理组织检查确诊的原发性EMPD患者,并电话随访至2019年3月。共33例,男26例,女7例,男女比例为26∶7。发病年龄51～83岁,平均发病年龄(70.46±8.79)岁。

对照组资料来自东南大学附属中大医院泌尿外科行包皮环切术的健康男性的正常包皮皮肤。25例男性患者,年龄40～53岁,平均年龄(45.26±3.46)岁。

1.2 主要试剂 福建迈新生物技术有限公司的Anti-E Cadherin antibody(ab40772)、Anti-beta Catenin antibody(ab32572)、液体DAB酶底物显色试剂盒、非生物素二步法免疫组化检测试剂盒、抗原修复液;自行配制的磷酸盐(PBS)缓冲液、其他如中性树胶、无水乙醇、二甲苯、丙酮、双氧水、双蒸水、伊红等试剂。

1.3 免疫组化 石蜡切片经过取材、甲醛固定、常规脱水、透明、石蜡包埋、4 μm连续均匀切片,在72℃下烤片1 h制成;然后常规脱蜡、苏木紫染色、盐酸乙醇分化、蒸馏水浸渍、伊红液浸泡、常规脱水、透明、封片、抗原修复、免疫组化二步法染色,最后显微镜下观察。

1.4 染色结果判定 目前,在对病理组织中免疫组化指标的定量尚无统一标准,本实验结果采用半定量积分法界定,E-钙黏蛋白和β-连环蛋白为细胞膜着色。(1)染色强度评分:棕褐色着色为3分,棕黄色着色为2分,浅黄色着色为1分,基本不着色为0分;(2)染色百分率评分:高倍镜下随机选取5个视野,每个视野计数200个细胞,计算阳性细胞平均百分比:阳性细胞百分比<5%为0分, 5%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,≥76%为4分;(3)以染色强度和染色百分率的评分之积进行结果判定:0分为阴性(-),1～3分为弱阳性(+),4～6分为阳性(++),≥7分为强阳性(+++)。其中,将强阳性及阳性定义为高表达,弱阳性定义为低表达。

1.5 统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行统计学分析,采用卡方检验和秩和检验等统计学方法进行数据处理,检验水准均采用α=0.05,P<0.05为有统计学意义;并且用spearman相关性分析E-钙黏蛋白及β-连环蛋白之间的关系,采用P<0.01为有统计学意义。

2 实验结果

2.1 E-钙黏蛋白在EMPD中的表达 E-钙黏蛋白阳性表达主要位于细胞膜上。33例EMPD患者病理组织中E-钙黏蛋白的强阳性表达率为0,阳性表达率为36.4%(12/33),弱阳性表达率为51.5%(17/33),阴性表达率为12.1%(4/33),见图1、2;E-钙黏蛋白在25例正常组织中全部为强阳性表达,见图4a。E-钙黏蛋白在EMPD和正常皮肤组织中的表达差异具有统计学意义(P<0.05),见表1。

图1 EMPD组织病理(HE,×40) 1a:原位性EMPD见表皮内成巢分布的Paget细胞;1b:侵袭性EMPD见Paget细胞侵袭至真皮层及毛囊;1c:转移性EMPD见Paget细胞累及真皮层 图2 E-钙黏蛋白在EMPD中的表达(免疫组化,×100) 2a:E-钙黏蛋白在原位性EMPD中的阳性表达;2b:E-钙黏蛋白在侵袭性EMPD中的弱阳性表达;2c:E-钙黏蛋白在转移EMPD中的弱阳性表达 图3 β-连环蛋白在EMPD中的表达(免疫组化,×100) 3a:β-连环蛋白在原位性EMPD中的阳性表达;3b:β-连环蛋白在侵袭性EMPD中的阳性表达;3c:β-连环蛋白在转移EMPD中的弱阳性表达

图4 4a:E-钙黏蛋白在正常组织中强阳性表达(免疫组化,×100);4b:β-连环蛋白在正常组织中强阳性表达(免疫组化,×200)

表1 E-钙黏蛋白在EMPD与正常皮肤组织中的表达

2.2 E-钙黏蛋白与EMPD患者临床和病理特征的关系 E-钙黏蛋白的表达与EMPD患者的年龄、性别、发病部位及淋巴结转移无显著相关性(P>0.05),与发生真皮浸润有显著相关性(P<0.05),E-钙黏蛋白的表达与EMPD临床及病理特征的关系,见表2。

表2 E-钙黏蛋白的表达与EMPD临床及病理特征的关系

2.3 β-连环蛋白在EMPD的表达 β-连环蛋白阳性表达主要位于细胞膜上,少数胞浆也有黄色颗粒状表达。33例EMPD患者病理组织中β-连环蛋白的强阳性表达率为3.0%(1/33),阳性表达率为54.5%(18/33),弱阳性表达率为24.2%(8/33),阴性表达率为18.2%(6/33),见图3;β-连环蛋白在25例正常组织中全部为强阳性表达,见图4b。β-连环蛋白在EMPD和正常皮肤组织中的表达差异具有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 β-连环蛋白在EMPD与正常皮肤组织中的表达

2.4 β-连环蛋白与EMPD患者临床和病理特征的关系 β-连环蛋白的表达与EMPD患者的年龄、性别、发病部位、真皮浸润及淋巴结转移无显著相关性(P>0.05)。见表4。

表4 β-连环蛋白的表达与EMPD临床及病理特征的关系

2.5 E-钙黏蛋白和β-连环蛋白在EMPD中表达的相互关系 33例EMPD患者中,12例E-钙黏蛋白高表达的患者中β-连环蛋白高表达9例,低表达3例,阴性表达0例;17例E-钙黏蛋白低表达的患者中β-连环蛋白高表达10例,低表达4例,阴性表达3例;4例E-钙黏蛋白低表达的患者中β-连环蛋白高表达0例,低表达1例,阴性表达3例;Spearman相关分析数据结果显示:E-钙黏蛋白与β-连环蛋白在EMPD患者病理组织中的表达呈正相关(r=0.490,P<0.01),见表5。

表5 EMPD中E-钙黏蛋白与β-连环蛋白表达的相关性

3 讨论

肿瘤的侵袭与转移在分子水平上我们将其分为这3个过程:细胞黏附、细胞表面基质降解、细胞运动增强。这一过程的前提是肿瘤细胞之间的细胞黏附力下降,而细胞黏附能力异常是上皮细胞间质化(EMT)的一个重要特征［7］。E-钙黏蛋白是Ca2+依赖性细胞黏附因子,主要介导细胞间黏附及维持细胞骨架的作用［4］。β-连环蛋白是一种具有多功能的蛋白质,既可以作为细胞黏附分子与E-钙黏蛋白结合形成黏附复合体,介导细胞间相互作用［8］,同时也可以作为信号转导分子,是wnt信号通路的重要元件,可以反向抑制E-钙黏蛋白的表达［9］。

E-钙黏蛋白作为介导细胞间黏附作用的主要分子,其表达的下降被认为是EMT的结果。EMT机制中的转录因子如ZEB家族、Slug、Snail及Twist家族均可竞争性结合E-钙黏蛋白基因的启动子［5］,抑制其转录表达,导致E-钙黏蛋白减少,细胞间黏附连接力丧失,促进肿瘤细胞从细胞团块上脱落,从而发生肿瘤的侵袭与转移。目前,在多个肿瘤中,E-钙黏蛋白表达的减少被认为与肿瘤的侵袭与转移相关,包括肝癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌等［5］。本实验中,EMPD患者的肿瘤组织E-钙黏蛋白表达明显低于正常组织,且原位组与侵袭组之间E-钙黏蛋白的表达差异具有统计学意义,但是E-钙黏蛋白在未转移组与转移组中的表达差异不具有统计学意义。因此我们可以推断,E-钙黏蛋白表达的降低与EMPD肿瘤发生侵袭具有相关性,但不能作为EMPD肿瘤转移和预后的独立指标。

一方面,在正常组织中β-连环蛋白与E-钙黏蛋白发挥同质黏附作用,抑制肿瘤的侵袭与转移;但是另一方面在肿瘤细胞中,β-连环蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路激活EMT机制,促使肿瘤的增生、侵袭及转移［6］。目前,已有研究发现β-连环蛋白在软组织肉瘤、甲状腺癌、宫颈癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌中异常表达,并且其表达的增强与上述肿瘤的侵袭、转移及预后相关［6,7］。但是,关于β-连环蛋白在EMPD中表达情况及与肿瘤发生侵袭、转移的关系研究的文献国内尚无报道,国外Ellis等［10］的研究中包含了63例EMPD患者,其中有8例侵袭性EMPD,结果显示β-连环蛋白在原位组与侵袭组中分别有9%和12%的患者中呈高表达,结果不具有统计学意义。在本研究中,β-连环蛋白在EMPD组中的表达明显低于正常组织,但是其表达与侵袭及转移无显著相关性,这一点与β-连环蛋白在其他肿瘤中的表达结果不同,但是与Patricia等结果相似。

在其他恶性肿瘤中,如甲状腺癌、乳腺癌等,由于EMT机制中的多条信号通路被激活,β-连环蛋白进入细胞内并且积累,E-钙黏蛋白表达下调,使肿瘤细胞间黏附作用丧失,促进了肿瘤的侵袭及转移。但是在本研究中,我们发现E-钙黏蛋白及β-连环蛋白在EMPD中的表达都在细胞膜上,明显低于正常组织,且两者表达呈正相关性。因此,笔者认为一方面E-钙黏蛋白及β-连环蛋白在EMPD中的表达是协同作用,共同维持细胞黏附作用;另一方面,推测β-连环蛋白在EMPD中并没有通过Wnt/β-catenin信号通路的激活促进肿瘤的转移。但是我们实验的样本量较小,侵袭及转移性EMPD所占比例较低,日后需要更多更大的样本量进行探究两者之间具体的发生机制。

综上所述,在EMPD中,E-钙黏蛋白表达的减少可以使EMPD肿瘤细胞间的黏附力降低,促使肿瘤的侵袭。我们需要更多研究去探索E-钙黏蛋白表达下调的机制,研发出促使肿瘤患者E-钙黏蛋白重新表达的新型靶向药物,为EMPD提供新的治疗方向。