CYP2E1介导酒精性心肌病的心脏纤维化作用及其机制

张荣怀,张珍侠,王凯燕,赵良玉,王艺金,4,王军奎,刘富强,于 凯#,郭海涛*

(1陕西省人民医院心血管内一科,西安 710068;2陕西省人民医院蒲城医院心血管内科;3空军军医大学基础医学院生理与病理生理学教研室;4西北大学生命科学学院;*通讯作者,E-mail:haitaoguo@fmmu.edu.cn;#共同通讯作者,E-mail:99885357@qq.com)

酒精滥用一直是全球范围内重要的公共健康问题。饮酒不仅可引起酒精性肝病,也会导致酒精性心肌病[1]。有研究发现,酒精可通过促进心肌纤维化和心室重构而抑制心脏功能[2]。因此,阐明饮酒导致心肌纤维化的发病机制并提出有针对性的治疗策略,对酒精性心肌病的诊治具有重大意义。

体内的酒精代谢途径主要包括酒精脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)和微粒体酒精氧化系统(microsomal ethanol oxidizing system, MEOS)。细胞色素P450家族成员2E1(CYP2E1)是药物代谢的MEOS系统的重要组成部分,主要分布在细胞的内质网和线粒体膜上,存在于机体的大多数器官中,如肝脏、消化道、大脑和肾脏等。CYP2E1作为酒精代谢主要的代谢酶,与酒精依赖以及相关疾病的发生发展密切相关[3]。研究显示,长期过量饮酒将导致肝脏ADH活性降低,但CYP2E1的活性升高5～10倍,因此,MEOS成为了长期过量饮酒机体内酒精代谢的主要途径[4]。课题组前期的研究发现,慢性酒精摄入将增加心脏CYP2E1的蛋白表达和活性,同时增加心肌纤维化,损伤心脏功能[5]。那么,酒精摄入后,CYP2E1是通过什么途径导致心肌纤维化,进而损伤心脏功能?目前还不是十分明确。

有研究显示,在各种损伤导致的心脏组织重构中,心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化(cardiac fibroblast-myofibroblast transformation, CMT)起着重要的作用[6,7]。与心脏成纤维细胞相比,心脏肌成纤维细胞具有很强的合成细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的能力。新合成的ECM虽可填充心肌细胞死亡造成的空隙,保证心脏结构的完整性[8],但也导致了心脏的广泛纤维化,减弱心脏的收缩功能,导致心律失常。有研究表明,饮酒可引起CMT[7,9],但其机制并不完全明确。

目前的研究显示,转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)途径在肌成纤维细胞转化机制中起着重要的作用[10]。在酒精摄入后的心脏中,TGF-β表达水平显著增高[11,12],而且TGF-β受体的表达也显著增加[13]。

那么,酒精摄入是否通过增加TGF-β水平,进而促进CYP2E1的表达,导致心脏成纤维细胞转化增多从而引起心肌纤维化?因此,本研究将通过酒精或TGF-β1作用于心脏成纤维细胞,观察心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化及纤维化的效应,以明确CYP2E1在酒精摄入促进CMT中的作用,并探讨其可能的分子机制,为酒精性心肌病的防治提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

出生1～3 d的SD乳鼠购自空军军医大学实验动物中心。胶原酶Ⅰ购自美国Sigma公司,高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司,Hyclone胎牛血清购自美国GE生命科学公司,二烯丙基硫醚(diallyl sulfide, DAS)购自美国Cayman Chemical公司。TGF-β1,Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)及CYP2E1抗体,Alexa Fluor594荧光二抗购自美国Proteintech公司。α-SMA及GAPDH抗体,DAPI购自美国Abcam公司。羊抗兔/羊抗鼠IgG购自康为世纪生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 心脏成纤维细胞培养 无菌条件下取出出生1～3 d的SD乳鼠心脏,剪碎心脏加入含0.1%胶原酶Ⅰ消化液,37 ℃水浴3～5 min,反复吹打,静置,弃去上清液。剩余沉淀再加入消化液,37 ℃水浴搅拌约5 min,反复吹打后将上清移至完全培养基(含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基)中。重复上述步骤,最后将收集的上清进行离心,取沉淀重悬于完全培养基中,移至培养瓶后,进行差速贴壁90～120 min,贴壁细胞主要为心脏成纤维细胞。将培养瓶中的培养基吸弃,更换为新鲜的完全培养基。将培养的心脏成纤维细胞传至2～4代后,接种于不同规格的培养皿中,用于后续实验。

1.2.2 实验分组 为研究酒精促进心肌纤维化的作用以及其作用是否通过CYP2E1来实现,将培养的心脏成纤维细胞随机分为:对照组(control)、酒精组(ethanol, 100 mmol/L)、二烯丙基硫醚(diallyl sulfide, DAS, CYP2E1抑制剂,100 μmol/L)组及ethanol+DAS组。为探讨酒精是否通过TGF-β促进心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化,将培养的心脏成纤维细胞随机分为:对照组(control)、肿瘤坏死因子β1组(TGF-β1, 10 ng/ml)、DAS组(100 μmol/L)及TGF-β1+DAS组。药物作用于心脏成纤维细胞24 h后,进行后续检测。

1.2.3 免疫荧光检测心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的水平 接种于共聚焦培养皿中的心脏成纤维细胞按照不同分组给予相应的药物。药物作用结束后用4%多聚甲醛固定10 min,以0.5% Triton X-100通透细胞10 min,给予α-SMA抗体(1∶1 000)避光孵育60 min,加入荧光二抗,最后加入DAPI孵育5 min,在共聚焦显微镜下观察并拍照,并用ImageJ进行定量分析。

1.2.4 Western blotting检测成纤维细胞CYP2E1、Collagen Ⅰ、TGF-β1蛋白水平 心脏成纤维细胞给予不同药物作用24 h后用裂解液裂解贴壁培养的成纤维细胞,分别将1.2.2各组的细胞裂解后提取细胞蛋白,用BCA法测定蛋白浓度。将提取的等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳,随后将蛋白电转至PVDF膜上。转膜后分别用CYP2E1、Collagen Ⅰ、TGF-β1和GAPDH抗体4 ℃孵育过夜。在室温环境下,用HPR标记的IgG二抗孵育1 h。用增强型化学发光液显色后进行信号采集。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 酒精对心脏成纤维细胞CYP2E1蛋白水平的作用

应用Western blotting方法检测酒精作用于心脏成纤维细胞后对CYP2E1蛋白水平的影响。结果发现,与对照组比较,酒精组心脏成纤维细胞的CYP2E1蛋白表达量显著增加(P<0.01);与酒精组比较,酒精+DAS组心脏成纤维细胞CYP2E1蛋白表达量的水平被显著抑制(P<0.05,见图1)。

2.2 CYP2E1介导酒精促进心脏成纤维细胞的转化

应用免疫荧光检测心脏成纤维细胞中α-SMA的表达水平。实验结果显示,当酒精作用于心脏成纤维细胞后,酒精组心脏成纤维细胞内的α-SMA表达水平显著高于对照组(P<0.01)。而与酒精组相比,给予酒精的同时加入CYP2E1特异性抑制剂DAS后,酒精+DAS组心脏成纤维细胞的α-SMA表达水平显著降低(P<0.01,见图2)。

红色荧光为α-SMA染色;蓝色荧光DAPI染色,显示细胞核

2.3 CYP2E1介导酒精促进心脏成纤维细胞合成细胞间质

应用Western blotting方法检测培养的心脏成纤维细胞Collagen Ⅰ的蛋白水平。结果发现,与对照组相比,酒精组在酒精作用于心脏成纤维细胞后,心脏成纤维细胞的Collagen Ⅰ蛋白表达水平显著升高(P<0.01);而与酒精组相比,酒精+DAS组心脏成纤维细胞Collagen Ⅰ的蛋白水平显著降低(P<0.05,见图3)。

与control组比较,**P<0.01;与ethanol组比较,#P<0.05

2.4 酒精对心脏成纤维细胞TGF-β1的作用

应用Western blotting方法检测酒精对心脏成纤维细胞TGF-β1蛋白表达水平的影响。结果显示,与对照组相比,酒精组心脏成纤维细胞TGF-β1蛋白水平显著升高(P<0.01)。而同时给予CYP2E1的抑制剂DAS后,与酒精组相比,酒精+DAS组心脏成纤维细胞的TGF-β1蛋白水平未出现显著改变(P>0.05,见图4)。

与control组比较,**P<0.01

2.5 TGF-β1促进心脏成纤维细胞的转化

心脏成纤维细胞给予TGF-β1(10 ng/ml)后,与对照组相比,TGF-β1组α-SMA水平显著升高(P<0.01)。而应用DAS抑制CYP2E1蛋白表达后,与TGF-β1组比较,TGF-β1+DAS组α-SMA的表达水平显著降低(P<0.01,见图5)。

红色荧光为α-SMA染色;蓝色荧光为DAPI染色,显示细胞核

3 讨论

饮酒是世界首要的疾病负担危险因素[14],酒精摄入将导致多种疾病的发生,其中包括酒精性心肌病[15]。超过50%的酗酒者患有心脏疾病,而且其中大部分人将最终死于心脏疾病[16]。酒精性心肌病不仅由于心肌细胞发生坏死和凋亡导致收缩功能受损,而且由于发生心肌纤维化,心脏的顺应性下降。两者共同作用将严重降低心脏功能,导致心脏疾病的发生。

CYP2E1是一种微粒体酒精氧化系统(MEOS)的重要组成部分,在酒精的代谢中起着至关重要的作用。长期酒精摄入将导致酒精代谢途径中乙醇脱氢酶蛋白水平和活性降低,却促进了CYP2E1的表达和活性的增高[4]。可见,CYP2E1在酒精代谢中起着至关重要的作用。本研究证明酒精可促进心脏成纤维细胞CYP2E1的表达。而在酒精作用的成纤维细胞中同时给予CYP2E1抑制剂DAS,将显著降低CYP2E1蛋白水平,提示酒精导致成纤维细胞的作用是通过CYP2E1来介导的。

在各种损伤导致的心脏组织重构中,占心脏细胞总数60%～70%的心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化起着重要的作用[17]。α-SMA是心脏肌成纤维细胞表达的一种特异性蛋白,可以作为心脏成纤维细胞活化的标志。本实验证实,在酒精的作用下,心脏成纤维细胞中α-SMA表达量显著升高,说明成纤维细胞发生了向肌成纤维细胞的转化。并且在应用CYP2E1抑制剂DAS后,心脏成纤维细胞中α-SMA表达量与酒精作用下相比显著减少。说明酒精通过CYP2E1途径介导了心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。

在病理损伤导致的组织重构中,新合成的ECM可填充死亡心肌细胞造成的空隙,保证心脏结构的完整性[8],但也导致了心脏的广泛纤维化。当心脏的成纤维细胞转化为肌成纤维细胞后,可以产生多种细胞外基质,其中具有代表性的组成成分包括Collagen Ⅰ。持续激活的肌成纤维细胞将导致组织顺应性降低[18,19]、心肌细胞萎缩、心律失常以及心肌氧供降低等,进一步损伤心脏功能。本研究发现给予酒精刺激心脏成纤维细胞后,细胞外基质的重要组成成分Collagen Ⅰ的含量显著升高,进一步证明酒精可以导致心脏的广泛纤维化。在应用CYP2E1抑制剂DAS后,显著抑制了酒精对肌成纤维细胞Collagen Ⅰ含量的升高作用。说明酒精导致的ECM大量合成可被CYP2E1抑制剂DAS所抑制,提示酒精促进心脏成纤维细胞活化及纤维化是由CYP2E1所介导。

目前大量研究发现,成纤维细胞的转化包括经典的TGF-β途径[10]。TGF-β是酒精摄入导致肝脏纤维化的重要细胞因子[20],有研究发现,在酒精摄入的动物心脏中TGF-β表达水平显著增高[9]。TGF-β可增加酒精导致的肝脏纤维化和损伤[4]。在阻塞输尿管导致的肾脏损伤中,TGF-β表达水平显著增高,肌成纤维细胞增多,而应用TGF-β的抗体或拮抗剂,可显著抑制肌成纤维细胞的转化,直接给予TGF-β则可促进培养的细胞发生肌成纤维细胞的转化[21]。本研究发现,酒精导致成纤维细胞TGF-β的重要亚型TGF-β1显著升高,而给予CYP2E1抑制剂DAS后并未影响酒精促进TGF-β1蛋白水平升高的作用,证明酒精对心脏成纤维细胞CYP2E1的作用与TGF-β的升高有关。

为进一步明确酒精的作用是否是通过升高心脏成纤维细胞的TGF-β导致的,直接应用TGF-β1刺激心脏成纤维细胞,结果发现心脏成纤维细胞的α-SMA水平显著升高,说明心脏成纤维细胞被显著活化,而此效应可被DAS抑制。本研究证明TGF-β1刺激心脏成纤维细胞α-SMA表达升高的作用是由CYP2E1介导的。

因此,酒精摄入可能是通过促进心脏成纤维细胞生成TGF-β1,从而增加CYP2E1的蛋白水平,进而介导心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化,引起心肌纤维化。这可能是酒精摄入导致心脏功能损伤的重要机制,通过对该机制的干预将可能成为酒精性心肌病防治的重要途径。