和厚朴酚对慢性哮喘模型大鼠气道炎症及气道重塑的抑制作用及其机制

南李刚,王贵佐,杨淑梅,刘 璐*

(1陕西省人民医院急诊科,西安 710068;2陕西省人民医院呼吸与危重症一科;*通讯作者,E-mail:liulu290@126.com)

支气管哮喘(简称哮喘)是一种常见的慢性呼吸系统疾病,以慢性气道炎症、气道高反应性和气道重塑为主要特征[1]。持续存在的气道炎症反应,以气道周围嗜酸性粒细胞、肥大细胞及CD4+T细胞浸润为主,并与气道上皮细胞、成纤维细胞、气道平滑肌细胞相互作用,分泌大量介质,进一步激活、募集炎症细胞,发挥协同促炎作用[2]。持续性炎症反应和气道反复损伤-修复导致气道重塑,是哮喘患者气流不可逆性受限、激素抵抗以及肺功能受损的病理基础[3],目前临床尚无疗效确切的防治措施。因此,探索哮喘气道炎症和重塑的分子机制,并寻找潜在干预药物,对于减轻气道炎症和气道重塑,进而改善哮喘的整体控制水平、预后及降低医疗成本具有重要意义。

和厚朴酚(honokiol, HKL)是一种双酚类化合物,是从中药厚朴的根及树皮中提取的重要单体,抗氧化能力是维生素E的1 000倍,还具有抗感染、抗炎、抗肿瘤及免疫调节作用[4,5]。研究发现,和厚朴酚可改善过敏性哮喘小鼠模型气道炎症反应[6],但其分子机制以及和厚朴酚是否同样可改善哮喘气道重塑严重程度,还需进一步研究。转录共激活因子Yes相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)是Hippo信号通路的核心效应分子,活化后通过调节下游基因发挥促炎、促增殖等作用。研究表明,和厚朴酚可通过激活TGF-β1/p38 MAPK信号通路促进YAP磷酸化失活、降解,抑制结肠癌SW620细胞增殖[7]。但和厚朴酚是否也可通过下调YAP调节哮喘气道炎症及重塑过程,还需进一步探讨。

因此,本研究应用卵清蛋白(ovalbumin, OVA)建立慢性哮喘大鼠模型,旨在评估和厚朴酚是否可抑制哮喘气道炎症和气道重塑,以及探讨其机制是否与和厚朴酚下调YAP表达相关,为哮喘防治策略提供实验依据和理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠24只,6周龄,体质量为 180～220 g,购于西安交通大学医学院实验动物中心(动物生产许可证SCXK(陕)2018-001)。

1.2 主要试剂

和厚朴酚粉剂(纯度≥98.0%)及OVA冻干粉(纯度≥97%)购于美国Sigma-Aldrich公司,地塞米松注射液(1 ml∶5 mg)购于中国遂成药业股份有限公司;兔抗大鼠t-YAP单克隆抗体购于中国上海艾博抗贸易有限公司,小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体、HRP标记羊抗兔二抗及HRP标记羊抗小鼠二抗均购自于美国Sigma-Aldrich公司;RIPA裂解液购自于中国上海碧云天公司,化学发光液购自于美国Milipore公司;IL-4及IL-17 ELISA检测试剂盒购自于美国R&D Systems,IL-6 ELISA检测试剂盒购自于美国LSBio公司。

1.3 慢性哮喘大鼠模型的构建

24只大鼠随机分为4组:对照组、OVA模型组、和厚朴酚组和地塞米松组,每组6只。配置新鲜造模液(1 mg OVA+100 mg十二水硫酸铝钾溶于1 ml PBS溶液中),OVA模型组、和厚朴酚组和地塞米松(阳性对照)组大鼠分别于第1,7,14天腹腔注射新鲜造模液致敏,对照组大鼠腹腔注射同等体积PBS。第21天起,将大鼠置于15 L密闭玻璃容器内,由雾化装置提供雾化动力,以1%的OVA(PBS溶解)进行雾化吸入激发,每次30 min,隔日激发1次,3次/周,连续激发8周(共24次)。对照组采用PBS雾化吸入,其他操作均相同。和厚朴酚组于每次OVA雾化前1 h腹腔注射和厚朴酚溶液(5 mg/kg),地塞米松组于每次OVA雾化前1 h腹腔注射地塞米松0.5 mg/kg。

1.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)及肺组织样本收集

末次激发后24 h处死大鼠,收集标本。用4 ℃预冷、无菌PBS 2.5 ml进行支气管肺泡灌洗,重复4次,收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF),并离心,上清液在-80 ℃保存备用。细胞沉淀用100 μl无菌PBS重悬,利用细胞计数板进行细胞总数计数;取细胞沉淀涂片行瑞氏-吉姆萨染色,光镜观察,计数细胞总数及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞数。支气管肺泡灌洗后分离部分肺组织并在-80 ℃保存。

1.5 肺组织病理学检查

取一部分肺组织固定于10%中性缓冲甲醛液,固定后的肺组织,经脱水、透明、石蜡包埋切片(5 μm)后,进行苏木精-伊红(HE)染色,观察肺组织病理学改变。

1.6 ELISA法检测血清及BALF中IL-4、IL-6、IL-17水平

样品处理:全血标本室温放置2 h后以1 000g离心20 min;BALF以1 000g离心20 min,收集上清液,保存于-20 ℃,避免反复冻融。检测前将ELISA试剂盒在室温平衡15～30 min后使用。严格按照说明书操作,设置对照孔、标准孔(梯度稀释标准品)、待测样品孔。封板、室温孵育、洗涤后加入HRP偶联抗体(IL-6试剂盒中HRP偶联抗体稀释100倍使用,IL-4、IL-17试剂盒中HRP偶联抗体无需稀释、直接使用)。重复封板、室温孵育,洗涤过程。每孔加入底物溶液,室温避光孵育后终止。立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度。IL-4、IL-6、IL-17 ELISA试剂盒的检测灵敏度分别为5 pg/ml、7.8 pg/ml和5 pg/ml。

1.7 免疫印迹法检测肺组织YAP表达水平

免疫印迹法检测大鼠肺组织YAP表达水平,β-actin作为内参。制备肺组织匀浆,使用RIPA裂解液提取总蛋白,测定蛋白浓度后按体积比4∶1加入上样缓冲液,100 ℃水浴锅变性。SDS-PAGE分离蛋白样本,采用湿转法将凝胶上的蛋白转至PVDF膜。使用封闭液充分封闭,转移至按1∶1 000稀释的一抗中孵育,4 ℃过夜,洗膜后转入按1∶5 000稀释的二抗中室温孵育2 h,再次洗膜后进行化学发光。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 和厚朴酚对肺组织病理改变的影响

OVA混悬液激发后模型组大鼠出现不同程度的喘息、呼吸频率变快、步履蹒跚、烦躁不安、腹肌痉挛阳性反应等现象。对照组大鼠无上述改变。和厚朴酚组和地塞米松组在OVA激发阶段,随着和厚朴酚和地塞米松的应用,大鼠喘息、呼吸加快、步履蹒跚、烦躁不安、腹肌痉挛阳性反应症状严重程度均较OVA模型组减轻,且两组间症状表现相似。

肺组织切片显示对照组大鼠的肺组织无明显炎性改变;OVA模型组大鼠可见支气管管壁、平滑肌层增厚,部分气道可见上皮细胞脱落坏死,支气管管腔狭窄,气道及血管周围大量炎性细胞浸润;与OVA模型组相比,和厚朴酚组及地塞米松组大鼠肺组织气道重构及炎症细胞浸润程度减轻,而和厚朴酚组与地塞米松组大鼠肺组织病理改变相似(见图1)。

图1 和厚朴酚对OVA诱导的慢性哮喘模型大鼠肺组织病理改变的影响 (HE染色,×200)

2.2 和厚朴酚对大鼠BALF炎性细胞数的影响

与对照组比较,OVA模型组BALF内炎性细胞总数、嗜酸性粒细胞计数和中性粒细胞计数明显增加(P<0.01);与OVA模型组比较,和厚朴酚组及地塞米松组大鼠BALF内炎性细胞总数、嗜酸性粒细胞计数和中性粒细胞计数均降低(P<0.01);和厚朴酚组与地塞米松组大鼠BALF炎性细胞总数、嗜酸性粒细胞计数和中性粒细胞计数差异无统计学意义(见图2)。

与对照组比较,**P<0.01;与OVA模型组比较,##P<0.01

2.3 和厚朴酚对大鼠血清及BALF中炎症因子的影响

与对照组比较,OVA模型组大鼠血清及BALF中IL-4、IL-6和IL-17浓度升高(P<0.01);与OVA模型组比较,和厚朴酚及地塞米松组大鼠血清及BALF中IL-4、IL-6和IL-17浓度均降低(P<0.01);和厚朴酚组与地塞米松组IL-4、IL-6和IL-17水平差异无统计学意义(见图3)。

与对照组比较,**P<0.01;与OVA模型组比较,##P<0.01

2.4 和厚朴酚对大鼠肺组织中YAP蛋白表达水平的影响

与对照组比较,OVA模型组大鼠肺组织中YAP蛋白水平较对照组升高至2.9倍(P<0.01);与OVA模型组相比,和厚朴酚组大鼠肺组织内YAP蛋白水平降至0.88倍(P<0.01,图4)。

与对照组比较,**P<0.01;与OVA模型组比较,##P<0.01

3 讨论

哮喘本质是一种慢性气道炎症性疾病,发病机制尚未完全明确,目前其发病机制可概括为免疫-炎症反应、神经调节机制及其相互作用。其中Th1/Th2失衡是重要因素之一,这一失衡导致Th2类细胞因子IL-4产生过多,进而诱导B淋巴细胞活化分泌特异性IgE,后者可促进肥大细胞增殖分化,进一步刺激炎性细胞因子分泌[8,9]。IL-6可由包括单核细胞、巨噬细胞在内的多种细胞分泌,与细胞膜上IL-6受体或IL-6受体的可溶性形式结合,随后该复合物与糖蛋白130(glycoprotein, gp130)结合,不仅可诱发和扩大炎症反应,而且能够抑制Th1细胞介导的细胞免疫反应。越来越多的证据表明IL-6信号在哮喘的发生发展中起重要作用。哮喘患者血清、痰液、BALF中IL-6水平升高,与肺功能损害和哮喘严重程度相关[10,11]。Th17/调节性T细胞(re-gulatory cells, Tregs)失衡也参与哮喘发生发展过程,尤其是在那些非嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘患者当中。Th17细胞分泌IL-17,可募集中性粒细胞;并促进支气管纤维母细胞、上皮细胞和平滑肌细胞活化,高度表达IL-6、IL-8和粒细胞集落刺激因子,加重气道炎症;参与气道重塑[12,13]。

现代药学研究发现,和厚朴酚可抗炎、抗氧化、抑制细胞增殖以及抗血管生成,在多种以异常炎症反应和细胞增殖为潜在病理机制的疾病中发挥保护作用[14,15]。研究表明,和厚朴酚预处理可减轻慢性过敏性哮喘小鼠肺组织炎症细胞浸润、胶原沉积以及气道杯状细胞增生,下调肺匀浆中包括IL-4、IL-6、IL-17在内的多种细胞因子水平[16]。这与本研究结果一致,即和厚朴酚可抑制哮喘炎症反应和气道重塑。

Hippo通路由一系列蛋白激酶和转录因子组成,具有高度保守性,参与调控细胞增殖、器官大小、肿瘤发生等多个生物学过程。作为Hippo信号通路的关键效应分子,YAP由上游MST1/2-LATS1/2磷酸化而失活,并堆积在胞浆中经泛素化途径降解。一旦Hippo通路失活,YAP去磷酸化并活化入核,与转录因子结合调控下游靶基因表达水平、参与调节细胞的多种生物学行为[17,18]。研究发现,异甘草酸镁通过抑制YAP改善肝星状细胞炎症反应和活化[19]。在哮喘领域研究发现,OVA致敏慢性哮喘小鼠模型中YAP水平明显升高,且YAP水平与气道ASM层厚度相关[20],提示Hippo-YAP信号通路可能参与哮喘病理过程。研究表明,和厚朴酚可阻断YAP入核发挥转录激活的作用,抑制结肠癌细胞增殖及克隆形成[21]。本研究结果显示,和厚朴酚可下调哮喘大鼠肺组织YAP水平,推测和厚朴酚抑制哮喘大鼠气道炎症及气道重塑的机制与其下调YAP表达相关,这为和厚朴酚在哮喘临床治疗上提供了实验依据。后续我们将从细胞层面进一步探索和厚朴酚抑制哮喘气道炎症及气道重塑的分子机制。