miR-125b-2-3p表达对鼻咽癌细胞HNE1增殖和凋亡的影响

陶 露,汤迎凯,韦卓利,项 平*

(1蚌埠医学院第一附属医院中心实验室,蚌埠 233000;2蚌埠医学院人体解剖学教研室;3蚌埠医学院组织移植安徽省重点实验室;*通讯作者,E-mail:byxiangping@163.com)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是由鼻咽上皮癌变引起的一种头颈部上皮性恶性肿瘤,在中国南方、北非和东南亚地区发病率较高[1-3]。近年来,随着放疗技术的进步,鼻咽癌早期治疗效果良好[4],然而,60%的新诊断患者的临床结果很差,他们通常表现为晚期疾病。因此,开发有效的治疗策略从而使这种致命疾病得以根除是至关重要的。

microRNA(miRNA/miRs)是一类非编码RNA,可通过与mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)碱基配对,增强mRNA降解或抑制其翻译,大约三分之一的人类基因可以被miRNA调控[5-7]。最近的研究表明,miRNA在许多人类疾病中异常表达,调控多种生物学作用,包括增殖、凋亡、迁移和分化,在肿瘤的发展过程中,miRNA既可以作为癌基因,也可以作为肿瘤抑制因子[8-10]。研究发现miR-125b-2-3p在结直肠癌[11]、乳腺癌[12]和口腔鳞状细胞癌[13]等肿瘤中发挥作用。miR-125b-2-3p在鼻咽癌中发挥何种作用?目前尚未发现相关研究。本研究通过分析miR-125b-2-3p在鼻咽癌细胞中的表达水平及其对鼻咽癌细胞HNE1增殖和凋亡的影响,为鼻咽癌的诊断和治疗提供新的依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株和主要试剂

鼻咽癌细胞HNE1和HK1为蚌埠医学院第一附属医院中心实验室冻存细胞,人永生化鼻咽上皮细胞NP69购自赛库生物技术有限公司。RPMI 1640购自美国Gibco公司;胎牛血清购自南美Lonsera公司;Lipofectamine®2000购自美国Invitrogen公司;mimics NC、miR-125b-2-3p mimics、inhibitor NC和miR-125b-2-3p inhibitor以及miR-125b-2-3p引物(序列:F:5′-CAGTGTCATCACAAGTCAGGCT-3′,R:5′-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′)购自吉玛基因股份有限公司;U6(货号HmiRQP9001)购自易锦生物技术有限公司;miRcute miRNA提取分离试剂盒购自天根生化科技有限公司;All-in-OneTMmiRNA定量检测体系购自美国GeneCopoeia公司;CCK-8检测试剂盒购自迈珂生物科技有限公司;Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒和DAPI染色液购自索莱宝科技有限公司;Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒和线粒体膜电位检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养与转染

HNE1、HK1和NP69细胞株均在5% CO2,37 ℃条件下培养,完全培养液是由10%胎牛血清和1%青-链霉素混合RPMI 1640配制。收集对数生长期HNE1细胞,计数并均匀铺板于6孔板,待细胞生长至密度约70%时进行细胞转染,分别转染mimics NC和miR-125b-2-3p mimics,inhibitor NC和miR-125b-2-3p inhibitor,然后验证转染效率。在后续实验中分为control组(未处理)、mimics NC组(Lip 2000+mimics NC)、miR-125b-2-3p mimics组(Lip 2000+miR-125b-2-3p mimics)、inhibitor NC组(Lip 2000+inhibitor NC)和miR-125b-2-3p inhibitor组(Lip 2000+miR-125b-2-3p inhibitor)。

1.3 荧光定量PCR检测miR-125b-2-3p表达水平

收集对数生长期细胞,根据miRcute miRNA提取分离试剂盒说明书提取总RNA,根据All-in-OneTMmiRNA定量检测体系使用说明书依次进行反转录和PCR反应,设置参数:95 ℃预变性10 min;95 ℃ 10 s,62 ℃ 20 s,72 ℃ 10 s,40个循环。以U6为内参,采用相对定量2-ΔΔCt方法计算。

1.4 细胞集落形成的测定

收集对数生长期转染后HNE1细胞并计数均匀铺板,培养期间间断观察细胞生长情况,7 d后终止培养。4%组织细胞固定液固定20 min,PBS洗2次,结晶紫染色15 min,拍照并统计集落形成数目。

1.5 CCK-8检测细胞增殖能力

收集对数生长期转染后HNE1细胞并计数,103/孔铺板于96孔板,分别在培养箱中培养24,48,72 h后终止培养,更换培养液,每孔加10 μl CCK-8溶液,在培养箱中孵育2.5 h使用酶标仪测定在450 nm处的吸光值。

1.6 活细胞/死细胞双染色检测细胞活力

收集对数生长期转染后HNE1细胞,计数后铺板于6孔板,分别在细胞培养箱中培养72 h后终止培养,PBS洗2次,根据Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒说明书,每孔依次加入1 μl Calcein-AM和3 μl PI孵育25 min,PBS洗2次,荧光显微镜使用(490±10)nm激发滤片观察拍照。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期转染后HNE1细胞并计数,均匀铺板于6孔板,4 h后更换新鲜培养液,继续培养36 h后终止培养,收集细胞并计数,取10万重悬细胞于1 000 r/min条件下离心5 min,根据Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书,分别依次加入195 μl Annexin Ⅴ-FITC结合液,5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl碘化丙啶染色液,轻轻混匀,避光孵育20 min,使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.8 线粒体膜电位检测细胞凋亡早期情况

收集对数生长期转染后HNE1细胞,计数铺板于6孔板,放置培养箱培养24 h后终止。根据线粒体膜电位检测试剂盒说明书,提前配置JC-1染色工作液和JC-1染色缓冲液(1×)备用。PBS洗涤细胞1遍,加入1 ml培养液和1 ml JC-1染色工作液,混匀,培养箱孵育20 min,JC-1染色缓冲液(1×)洗2次,加入2 ml培养液。在荧光显微镜下观察和拍照。线粒体膜电位下降标志细胞凋亡早期,红/绿荧光强度比值表示细胞去极化程度,比值越高说明膜电位越高[14]。

1.9 细胞核DAPI染色

取对数生长期转染后HNE1细胞计数铺板于6孔板,培养24 h后终止,PBS洗2次,4%组织细胞固定液固定20 min,PBS洗2次,DAPI染色液染色15 min,洗涤后于荧光显微镜下观察细胞核形态。

1.10 统计学分析

使用SPSS16.0进行统计分析,数据以均数±标准差表示,两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-125b-2-3p在鼻咽癌细胞HNE1中的表达

结果显示,miR-125b-2-3p在HNE1、HK1和NP69细胞中均有表达,与人永生化鼻咽上皮细胞NP69相比,miR-125b-2-3p在鼻咽癌细胞中表达较高,差异有统计学意义(P<0.05,见图1)。与control组和mimics NC组相比,miR-125b-2-3p在miR-125b-2-3p mimics组中表达上调(P<0.01);与control组和inhibitor NC组相比,miR-125b-2-3p在miR-125b-2-3p inhibitor组中表达下调(P<0.01,见图2)。

与人永生化鼻咽上皮细胞NP69比较,*P<0.05,**P<0.01

与control组和相应的NC组比较,**P<0.01

2.2 miR-125b-2-3p对鼻咽癌细胞HNE1增殖的影响

结果表明,与mimics NC组相比,miR-125b-2-3p mimics组吸光值较高(P<0.01);与inhibitor NC组相比,miR-125b-2-3p inhibitor组吸光值较低(P<0.01,见图3)。细胞集落形成实验结果显示,与mimics NC组相比,miR-125b-2-3p mimics组细胞集落数目较多(P<0.01);与inhibitor NC组相比,miR-125b-2-3p inhibitor组细胞集落数目较少(P<0.01,见图4)。活细胞/死细胞双染色检测结果表明,相较于mimics NC组,miR-125b-2-3p mimics组活细胞较多;相较于inhibitor NC组,miR-125b-2-3p inhibitor组活细胞较少(见图5)。

与各自对应的NC组比较,**P<0.01

与各自对应的NC组比较,**P<0.01

黄绿色荧光表示活细胞;红色荧光表示死细胞

2.3 miR-125b-2-3p对鼻咽癌细胞HNE1凋亡的影响

流式细胞术检测结果表明,与mimics NC组相比,miR-125b-2-3p mimics组细胞凋亡率较低(P<0.01);与inhibitor NC组相比,miR-125b-2-3p inhibitor组细胞凋亡率较高(P<0.01,见图6)。线粒体膜电位(JC-1)检测结果表明,与mimics NC组相比,miR-125b-2-3p mimics组细胞红/绿荧光强度比值较高;相较于inhibitor NC组,miR-125b-2-3p inhibitor组红/绿荧光强度比值较低(P<0.05,见图7)。DAPI细胞核染色检测结果表明,相较于inhibitor NC组,miR-125b-2-3p inhibitor组细胞出现核固缩和核碎裂较多(见图8)。

与各自对应的NC组比较,**P<0.01

与各自对应的NC组比较,**P<0.01

蓝色荧光表示细胞核;红色箭头指核固缩和核碎裂

3 讨论

microRNA广泛参与各种关键的细胞过程,miRNA通过降解靶基因转录本和抑制mRNA的翻译在许多类型的肿瘤细胞中发挥作用[15,16]。有报道称miRNA在鼻咽癌的发生发展中发挥着重要作用,例如miRNA-520c-3p在鼻咽癌组织和细胞系中表达下调,鼻咽癌肿瘤分级越重、肿瘤越大miRNA-520c-3p表达水平越低,miRNA-520c-3p过表达使细胞周期停滞在G0/G1期,抑制细胞增殖能力[17]。本研究以miR-125b-2-3p为研究对象,通过荧光定量PCR检测miR-125b-2-3p在人永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞中的表达,结果发现相较于人永生化鼻咽上皮细胞NP69,miR-125b-2-3p在鼻咽癌细胞中表达上调,说明miR-125b-2-3p在鼻咽癌诊断中具有潜在的价值。

lncRNA AC007271.3上调在体外促进细胞增殖、迁移、侵袭,抑制细胞凋亡,在体内促进肿瘤生长,研究表明AC007271.3通过与miR-125b-2-3p结合,破坏primary miR-125b-2的稳定,作为竞争内源性RNA,导致miR-125b-2-3p的直接靶标Slug的表达上调,促进口腔鳞状细胞癌的发展[13]。也有研究表明miR-125b-2-3p上调通过靶向EGR1作为透明细胞肾细胞癌转移的重要启动子,促进透明细胞肾细胞癌的发展[18]。miR-125b-2-3p在肿瘤发展中发挥重要的作用。为了进一步阐明miR-125b-2-3p在鼻咽癌细胞HNE1中的生物学功能,本研究构建了下调或上调miR-125b-2-3p表达水平的鼻咽癌细胞HNE1转染细胞株。实验结果显示,在鼻咽癌细胞HNE1中转染miR-125b-2-3p inhibitor后,与转染inhibitor NC相比miR-125b-2-3p表达水平明显下调;相较于inhibitor NC组,miR-125b-2-3p inhibitor组细胞增殖能力明显受到抑制,细胞凋亡增多,说明下调miR-125b-2-3p能够抑制鼻咽癌细胞HNE1的体外增殖,促进HNE1细胞的凋亡。细胞凋亡是在基因水平上受到调控,从而有序和有效地清除受损细胞,癌前病变中DNA损伤导致的细胞凋亡可以清除潜在的有害细胞,从而阻止肿瘤的生长,这一死亡过程的解除与未受抑制的细胞增殖、癌症的发展和进展有关[19,20]。因此,推测可能通过miR-125b-2-3p下调使鼻咽癌细胞增殖受到抑制,细胞凋亡增加,从而抑制鼻咽癌的发展。

综上,本研究初步证实了下调miR-125b-2-3p能够抑制鼻咽癌细胞HNE1的增殖,促进HNE1细胞的凋亡。microRNAs是许多细胞过程的关键调控因子,在癌症中经常被解除控制,包括细胞凋亡,miRNAs可能通过分别直接靶向促凋亡或抗凋亡mRNA,同时发挥促凋亡和抗凋亡的作用[21],将miRNA作为合成miRNA模拟物或抑制物已经成为一种很有前途的治疗癌症的方法。因此,推测miR-125b-2-3p对鼻咽癌细胞凋亡的影响可能是通过靶向调控下游mRNA发挥作用,由于实验的局限性尚未研究。未来我们将深入研究miR-125b-2-3p上下游调控鼻咽癌生物学功能的潜在分子,为进一步了解鼻咽癌发生机制以及临床靶点治疗提供新的理论依据。