植物根际细菌HQ1-2的根际定殖与土壤微生态调节及枯萎病防治

陈梦多，胡春艳，马肖静，何梦菡，沈虎生，王艺茹，朴凤植，申顺善*

（1.河南农业大学园艺学院，郑州 450002；2.河南农业大学植物保护学院，郑州 450002）

黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型Fusariumoxysporumf.sp.cucumberium引起的一种真菌性土传病害，病原菌从黄瓜根茎部侵入并寄生于维管束内，阻碍植株对水分和养分的吸收，最终引起植株萎蔫枯死。植物根际促生细菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是生存在植物根圈范围，对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌统称，对植物生长和病害防治具有重要的作用[1,2]。PGPR 可以通过多种机制促进植物生长，如溶磷、解钾、生物固氮作用、产生植物激素、产生铁载体、产生1-氨基环丙烷-1-羟酸脱氨酶（ACC）、群体感应信号干扰和抑制生物膜形成、产生挥发性有机化合物、诱导植物系统抗性等，直接促进植物生长和减轻病害发生或改善植物根际土壤微生态，进而促进植物生长[3-6]。近年来，利用PGPR 改善植物根际土壤微生态环境，保持土壤健康，防治土传病害受到广泛关注。如：解淀粉芽胞杆菌TR2 和CE 菌株依据其解磷、解钾能力促进西瓜幼根和茎的生长[7]；从大豆根际土壤中分离的四株溶磷菌分泌IAA 和有机酸促进大豆生长[8]；Ben 等[9]发现的两株假单胞杆菌通过分泌嗜铁素能够有效持久地抑制康乃馨镰刀菌枯萎病的发生，并能够诱导康乃馨植株对镰刀菌的抗性；另外，王艳宇[10]研究发现耐盐菌S29、KM1 和NM8 能够在绿豆根际定殖，并增加土壤细菌的多样性和丰富度，增加土壤中有益菌的相对丰度，进而促进绿豆的生长。

本研究从河南省驻马店健康番茄根际分离、筛选得到一株植物根际促生菌HQ1-2，研究其在黄瓜根际的定殖能力，明确其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，评价其对黄瓜枯萎病的防治效果和对黄瓜根际土壤微生态的调节效果，为黄瓜枯萎病的生物防治提供生防资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株HQ1-2 是从河南省驻马店番茄根际分离筛选获得，采用逐步提高诱导浓度的方法获得稳定抗利福平（100 μL/mL）的菌株，并保存于-80 ℃超低温冰箱。供试黄瓜枯萎病菌尖孢镰刀菌黄瓜专化型Fusariumoxysporumf.sp.cucumberium（FOC）是由本研究室分离鉴定并保存。供试黄瓜品种为“寒育6号”，由河南豫艺种业科技发展有限公司提供。供试化学药剂50%多菌灵可湿性粉剂由苏州遍净植保科技有限公司提供。供试培养基为PDA 培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉18 g，超纯水1000 mL）、TSA 培养基（胰酪大豆胨液体培养基（TSB）30 g，琼脂粉18 g，超纯水1000 mL）、PDB 培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，超纯水1000 mL）和AIA 培养基（Actinomycete Isolation Agar Difco.20 g，超纯水1000 mL）。

1.2 HQ1-2 菌悬液的配制

将HQ1-2 菌株在TSA 培养基上划线培养3 d 后，刮取菌落用无菌水配制成浓度为108cfu/mL 的菌悬液待用。

1.3 尖孢镰刀菌FOC 孢子悬浮液的配制

将在PDA 培养基上培养的尖孢镰刀菌菌饼接种到PDB 培养基，恒温振荡培养（28 ℃，转速160 r/min）5 d 后，用灭菌纱布过滤获得孢子悬浮液，再用无菌水稀释配制成浓度为1×107孢子/mL 的孢子悬浮液。

1.4 HQ1-2 在黄瓜根际定殖密度测定

HQ1-2 在黄瓜根际定殖密度测定采用稀释涂布平板法。将一片真叶的黄瓜苗移栽到花盆（直径9.0 cm×深度7.5 cm），灌注处理HQ1-2 菌悬液（108cfu/mL）100 mL/株，待2 h 后灌根接种FOC 孢子悬浮液（1×107孢子/mL）10 mL/株，置于温室培育。以清水做对照，每个处理3 次重复，每个重复15 株。处理第3 d开始每隔3 d 采集黄瓜根系和根际土壤测定HQ1-2 的定殖密度。即：轻轻拔出黄瓜根系，用流水冲洗干净，再用无菌水冲洗3 次，吸干根表面水分，称取1 g 研磨，然后用无菌水稀释获得10-3～10-4的根系稀释液；称取1 g 根际土壤，用无菌水稀释获得10-5～10-6的根际土壤稀释液，将根系和根际土壤稀释液分别涂抹在加利福平（100 μg/mL）的TSA 培养基上，置于28 ℃恒温箱中培养48 h，待形成菌落，调查菌落数并推算HQ1-2 的定殖密度。

1.5 黄瓜根际土壤微生物测定

HQ1-2 和FOC 的接种方法同1.4。处理20 d 后，采用稀释涂布平板法测定黄瓜根际土壤可培养细菌、真菌和放线菌数量。称取过筛（60 目筛）过的根际土壤1 g，倒入装有100 mL 无菌水的三角瓶，充分震荡后静置30 min，然后稀释获得10-4～10-7的土壤稀释液，将0.1 mL 的10-6～10-7的稀释液均匀涂布在TSA培养基，在28 ℃恒温箱中培养3 d 后调查细菌菌落数；将0.1 mL 的10-4～10-5的稀释液均匀涂布在PDA培养基，在28 ℃恒温箱中培养5 d 后调查真菌菌落数；将0.1 mL 的10-5～10-6的稀释液均匀涂布在AIA培养基，在28 ℃恒温箱中培养7 d 后调查放线菌菌落数。调查细菌和真菌采用新鲜土样，调查放线菌采用风干的土样。

1.6 黄瓜根际土壤酶活性测定

HQ1-2 和FOC 的接种方法同1.4。处理20 d 后测定黄瓜根际土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性。脲酶活性测定采用苯酚钠-次氯酸钠比色法，磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法，蔗糖酶活性测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法，过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法[11]。

1.7 黄瓜根际土壤速效氮磷钾含量测定

HQ1-2 和FOC 的接种方法同1.4。处理20 d 后采用TRF-3A 型土壤养分速测仪测定黄瓜根际土壤速效氮、磷、钾含量[12]。

1.8 HQ1-2 对尖孢镰刀菌的抑制活性测定

HQ1-2 对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制效果测定采用平板对峙培养法，对孢子萌发的抑制效果测定采用悬滴法[13]。

1.9 HQ1-2 对黄瓜枯萎病的防治效果测定

HQ1-2 对黄瓜枯萎病的防治效果测定采用盆栽试验。HQ1-2 和FOC 的接种方法同1.4，处理后置于温室培养14 d 后调查枯萎病发病情况，并计算病情指数和防治效果。以清水处理和化学药剂（50%多菌灵可湿性粉剂500 倍液，100 mL/株）做对照，每个处理3 次重复，每个重复15 株。调查枯萎病分级标准：0级为无症状；1 级为子叶黄化，但未萎蔫；2 级为子叶萎蔫；3 级为子叶和真叶萎蔫或植株矮化；4 级为全株枯死[14]。

病情指数＝Σ（病级数×该病级植株数）/（最大病级数×植株总株数）×100，防治效果（%）＝（对照组病情指数－处理组病情指数）/对照病情指数×100。

1.10 HQ1-2 的鉴定

根据形态特征、生理生化特性和16S rRNA 序列同源性分析鉴定菌株HQ1-2，形态特征和生理生化特性测定主要参考伯杰氏细菌鉴定手册的常规细菌学鉴定方法[15]。16S rRNA 序列同源性分析主要参考潘培培等[16]的方法。

1.11 数据统计与分析

采用SPSS 26 和Excel 2013 软件进行数据分析，以最小显著差数法（LSD）分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 HQ1-2 的定殖密度

HQ1-2 在黄瓜根系和根际土壤均具有稳定的定殖能力。从图1 看出，在黄瓜根系，没有接种FOC 条件下，处理3 d 时定殖密度为5×104cfu/g，处理第6 d 时定殖密度最高，后降低，处理12 d 时定殖密度仍能达到1.43×104cfu/g；接种FOC 条件下，处理3 d 时定殖密度为2.70×104cfu/g，后慢慢增多，处理12 d时定殖密度能达到5.23×104cfu/g。HQ1-2 在黄瓜根系的定殖密度未接种FOC 条件下先高后降趋势，而接种FOC 条件下先低后增趋势，到处理12 d 时显著高于未接种FOC 条件。从图2 看出，在黄瓜根际土壤，没有接种FOC 条件下，处理3 d 时定殖密度为7.97×106cfu/g，然后定殖密度比较稳定，处理12 d 时定殖密度仍能达到8.33×106cfu/g；接种FOC 条件下，处理3 d 时定殖密度为4.83×106cfu/g，后慢慢增多，到处理第12 d 时定殖密度能达到1.18×107cfu/g。HQ1-2 在黄瓜根际土壤的定殖密度在未接种FOC 条件下基本稳定的定殖密度，而接种FOC 条件下先低后增，到处理12 d 时显著高于未接种FOC 条件。

图2 HQ1-2 在黄瓜根际土壤的定殖密度Fig.2 Colonization density of HQ1-2 in the rhizosphere soil of cucumber

2.2 HQ1-2 对黄瓜根际土壤微生态的影响

2.2.1 根际土壤微生物 从表1 看出，HQ1-2 处理显著增加黄瓜根际土壤可培养细菌数量，在未接种FOC条件下，HQ1-2 处理的黄瓜根际土壤细菌数量比对照增加22.60%；在接种FOC 条件下，HQ1-2 处理的黄瓜根际土壤细菌比只接种FOC 处理增加31.39%。HQ1-2 处理明显降低根际土壤可培养真菌数量，在未接种FOC 条件下，HQ1-2 处理的黄瓜根际土壤真菌数量比对照减少20.91%；在接种FOC 条件下，HQ1-2处理的黄瓜根际土壤真菌比只接种FOC 处理减少39.55%。在未接种FOC 条件下，HQ1-2 处理对黄瓜根际土壤放线菌无显著影响，而在接种FOC 条件下，HQ1-2 处理的黄瓜根际土壤放线菌比只接种FOC 处理增加了39.86%。

表1 HQ1-2 处理对黄瓜根际土壤可培养微生物的影响Table 1 Effects of HQ1-2 on culturable microbial population in the rhizosphere soil of cucumber

2.2.2 根际土壤酶活性 从表2 看出，在未接种FOC 条件下，HQ1-2 处理对黄瓜根际土壤酶活性没有显著影响；接种FOC 明显降低黄瓜根际土壤酶活性，在接种FOC 条件下，HQ1-2 处理显著提高黄瓜根际土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性，分别比只接种FOC 处理分别提高了56.12%、16.25%、45.95%和147.30%。

表2 HQ1-2 处理对黄瓜根际土壤酶活性的影响Table 2 Effects of HQ1-2 on enzymatic activity in the rhizosphere soil of cucumber

2.2.3 根际土壤速效氮磷钾含量 从表3 看出，在未接种FOC 条件下，HQ1-2 处理显著增加黄瓜根际土壤速效磷和速效钾含量，而对速效氮含量没有显著影响；接种FOC 显著降低了黄瓜根际土壤速效氮、速效磷和速效钾含量，在接种FOC 条件下，HQ1-2 处理显著提高了黄瓜根际土壤速效氮、速效磷和速效钾含量，分别比只接种FOC 处理增加44.78%、154.36%和48.71%。

表3 HQ1-2 处理对黄瓜根际土壤速效营养的影响Table 3 Effects of HQ1-2 on available nutrients in the rhizosphere soil of cucumber

2.3 HQ1-2 对尖孢镰刀菌的抑菌效果

HQ1-2 对尖孢镰刀菌菌丝生长、孢子形成和孢子萌发均有较强的抑制活性，从图3 可以看出，HQ1-2 显著抑制FOC 菌丝生长，形成明显的抑菌带。从图4 看出，在PDB 培养液振荡培养5 d 时，对照处理的FOC 产孢量为1.65×108孢子/mL，而HQ1-2 处理的产孢量仅为4.10×107孢子/mL，HQ1-2 对FOC 孢子形成的抑制效果达到75.15%。从图5 看出，在无菌水中培养2 h 时FOC 分生孢子萌发率为17.22%，培养8 h 时萌发率达到92.78%，而HQ1-2 处理的分生孢子2 h 时没有萌发，培养8 h时萌发率仅为9.87%，HQ1-2 对FOC 孢子萌发的抑制效果达到89.36%。

图3 HQ1-2 对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制效果Fig.3 Antifungal effect of HQ1-2 against mycelial growth of Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum

图4 HQ1-2 对尖孢镰刀菌分生孢子形成的抑制效果Fig.4 Inhibitiory effect of HQ1-2 against conidia formation of Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum

图5 HQ1-2 对尖孢镰刀菌分生孢子萌发的抑制效果Fig.5 Inhibitiory effect of HQ1-2 against conidia germination of Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum

2.4 HQ1-2 对黄瓜枯萎病的防治效果

在盆栽试验中，HQ1-2 对黄瓜枯萎病具有显著的防治效果。从表4 和图6 看出，接种FOC 的对照黄瓜苗生长明显受到抑制，处理第10 d 时底部叶片变黄、开始萎蔫，第14 d 时植株严重萎蔫枯死，病情指数为68.33；而HQ1-2 处理的黄瓜苗，第10 d 开始底部叶片表现轻微变黄，第14 d 时病情指数为13.33，HQ1-2 处理对黄瓜枯萎病的防治效果达到80.49%，处理第14 d 时化学药剂处理对黄瓜枯萎病的防治效果达到65.36%。

表4 HQ1-2 对黄瓜枯萎病的防治效果Table 4 The control effect of HQ1-2 against Fusarium wilt of cucumber

图6 HQ1-2 对黄瓜枯萎病防治效果Fig.6 The control efficiency of HQ1-2 against Fusarium wilt of cucumber

2.5 HQ1-2 的鉴定

HQ1-2 菌体为直杆状，革兰氏阳性，在TSA 培养基上形成乳白色，半透明，表面光滑，边缘不规则的菌落（图7）。在5 ℃～50 ℃范围内均能生长，耐盐度低于3%，可以利用葡萄糖、甘油、蔗糖和麦芽糖，不能利用半乳糖、单宁酸和柠檬酸，亚硝酸还原反应、淀粉水解反应呈阳性，硝酸盐还原反应、明胶液化呈阴性（表5）。以HQ1-2 菌株总RNA 为模板，PCR 扩增出的16S rRNA 长度为1579 bp，进行NCBI BLAST 比对分析结果，与多粘类芽胞杆菌的16S rRNA 序列同源性达到99%，利用MEGA 软件构建系统发育树结果，与多粘类芽胞杆菌Paenibacilluspolymyxa（MK911741.1）在一个分支，其支持度为100%。因此，根据形态特征、生理生化特性和16S rRNA 序列同源性分析，将HQ1-2 鉴定为多粘类芽胞杆菌。

表5 HQ1-2 和多粘类芽胞杆菌的形态特征和生理生化特性Table 5 Morphological characteristics and physiological and biochemical characteristics of HQ1-2 and Paenibacillus polymyxa

图7 HQ1-2 菌落图Fig.7 Colony morphology of HQ1-2

图8 基于16S rRNA 序列构建的HQ1-2 系统发育树Fig.8 The phylogenetic tree of HQ1-2 constructed based on 16S rRNA sequence

3 讨论

植物根际促生菌的根际定殖是其在植物根部和根际土壤生存并繁殖的能力，是在植株体内大量繁殖并保持一定的密度是其发挥作用的前提[17,18]。如西瓜内生细菌C18的定殖能力影响着其生防效果，在西瓜体内定殖数量减少，其生防效果就会下降[19]；枯草芽胞杆菌XF-1 能在大白菜根围、根表和根内长时间定殖，有利于其在根部占据生态位点，从而抑制白菜根肿病菌的侵染和繁殖[20]；普城沙雷菌A21-4 和绿针假单胞菌HG28-5 均具有稳定的定殖能力，在辣椒根部和根际土壤中保持一定的定殖密度，能使其发挥促生和防病作用[21]。本研究的HQ1-2 在黄瓜根系和根际土壤均稳定地保持一定的定殖密度，并在接种FOC 条件下定殖密度明显增加且稳定，为HQ1-2 发挥其防病作用奠定基础，但其定殖机理有待于进一步探讨。

植物根际土壤是植物与外界环境进行物质交换和能量交换的主要场所，植物根际土壤微生物、土壤酶活性、土壤理化性质与寄主植物生长有密切关系。土壤微生物直接参与植物根际有机质的分解和养分的快速转化[22]。植物根际土壤微生物有有益和有害的，有益微生物能调节土壤微生态环境有助于植物生长，有害微生物引起植物病害会影响植物正常生长。植物根际促生菌能够影响植物根际土壤微生物群落结构，进而影响土壤酶活性和土壤速效营养，有利于植物生长和防治病害。如枯草芽胞杆菌XS-4 和贝莱斯芽胞杆菌XS-20-15 菌剂显著影响连作土壤中真菌群落结构[23]；贝莱斯芽胞杆菌P1 改变辣椒根际土壤细菌和真菌群落结构和组成，促进了辣椒植株体内全氮和全磷含量[24]；生防菌W5 和Y1 增加马铃薯根际土壤细菌和真菌的多样性，同时改变了马铃薯根际土壤微生物物种组成[25]；王亚月等[26]研究发现生防菌亚麻假单胞菌、沙福芽胞杆菌、暹罗芽胞杆菌、哈茨木霉菌能够改变土壤菌群丰度，表现出对烟草黑胫病的防治效果。土壤酶活性反映土壤健康状况，土壤过氧化氢酶能够转化土壤中的有机质，土壤脲酶能促进氮素循环，土壤磷酸酶与土壤有机磷的转化有关。植物根际促生菌能够影响着植物根际土壤酶活性，有利于植物吸收利用土壤速效养分[27]。如解淀粉芽胞杆菌TR2 处理提高草莓根际土壤酶活性，提高了土壤肥力从而达到了促生长的效果[28]。本研究结果，HQ1-2 显著影响黄瓜根际土壤细菌、真菌和放线菌的数量，提高根际土壤酶活性，增加根际土壤速效氮磷钾含量，进而促进黄瓜生长，其具体的相关性有待于进一步的探索。

黄瓜枯萎病菌以菌丝体或厚垣孢子在土壤中长期存活，土壤中的菌丝和厚垣孢子萌发侵入黄瓜根部或藤蔓，在受害部位产生大量的分生孢子引起再次侵染。因此，抑制病原菌的任何一个发育阶段都能够切断病原菌的侵入和传播，有效防治黄瓜枯萎病。如从蚯蚓粪中筛选出的一株黄瓜枯萎病拮抗菌株WQ-5 能够抑制FOC 菌丝生长，在盆栽试验防治黄瓜枯萎病[29]；比基尼链霉菌HD-087 菌株发酵液能够抑制FOC 菌丝生长和分生孢子萌发，对黄瓜枯萎病具有明显的防治效果[30]；卡那链霉菌CA-6 发酵液具有强烈的抑菌活性，抑制黄瓜枯萎病菌分生孢子萌发及菌丝生长，防治黄瓜枯萎病[31]。本研究结果，HQ1-2 不仅能抑制FOC 菌丝生长，还能抑制孢子形成和孢子萌发，进而防治黄瓜枯萎病，显示其生防潜力。

植物根际存活大量的微生物，其中很多是具有促进植物生长和抑制植物病害等作用的促生菌。已报到的植物根际促生菌种类很多，其中多粘类芽胞杆菌是类芽胞杆菌属的革兰氏阳性细菌，具有产抗生素、产激素类物质、诱导植物产生系统抗性等，具有多种功能的一类重要的植物根际促生菌[32]，被美国环保署定为可作商用的微生物之一[33]，最近很受广大研究者的关注，用于防治多种植物病害。如，多粘类芽胞杆菌HK18-8 菌悬液对辣椒炭疽病的防治效果可达到88.58%[34]，多粘类芽胞杆菌DY04 可有效防治小麦赤霉病[35]，多粘类芽胞杆菌LRS-1 通过改变根际土壤细菌多样性可有效防治辣椒疫病[36]。本研究筛选出的HQ1-2 菌株为多粘类芽胞杆菌，具有稳定的根际定殖能力，对黄瓜枯萎病菌有较强的抑菌活性，防治黄瓜枯萎病，并对黄瓜根际土壤微生态环境具有较好的调节作用，是一株具有应用潜力的生防资源。