高温对川硬皮肿腿蜂发育及Wolbachia携带的影响

唐艳龙，康 奎，陈思琪，王丽娜，车华涛，王小艺，魏 可*

（1.遵义师范学院生物与农业科技学院/贵州省赤水河流域动物资源保护与应用研究重点实验室，遵义 563002；2.中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所/国家林业和草原局森林保护学重点实验室 北京 100091）

川硬皮肿腿蜂Sclerodermussichuanensis是我国继管氏肿腿蜂S.guaui之后于1994 年在四川泸县发现的一种寄生于粗鞘双条杉天牛Semanotussionanster幼虫的硬皮肿腿蜂属天敌昆虫[1]。川硬皮肿腿蜂寄主搜索能力强、寄主谱广、繁殖能力强，目前已广泛应用于松褐天牛Monochamusalternatus、星天牛Anoplophora chinensis、双条杉天牛S.bifasciatus、花椒虎天牛Clytusvalidus等林木蛀干害虫的防治[2,3]。

温度是影响寄生蜂繁殖力和发育速率的关键环境因子之一。前期研究发现管氏肿腿蜂在27 ℃下产卵量最高[4]；当温度在21～33 ℃时，松褐天牛肿腿蜂S.alternatusi各虫态发育历期随着温度的升高而缩短，且子代数量在27 ℃时最多[5]；白蜡吉丁肿腿蜂S.pupariae幼期发育速率同样随温度的升高而加快，单雌子代数从21 ℃时的58 头提升至30 ℃时的91 头[6]。前期研究中有关川硬皮肿腿蜂发育与温度的关系，发现世代周期随温度增加（22～28 ℃）而缩短[1]；川硬皮肿腿蜂适宜贮存在6～15 ℃低温条件下，12 ℃是其最适贮存温度[7]。有关该寄生蜂在高温环境下的生殖和发育特征还未见报道。

沃尔巴克氏体Wolbachia是广泛存在于节肢动物及线虫体内的一类胞内共生菌，其可通过胞质不亲和、雌性化、杀雄作用、孤雌生殖等方式来调控宿主的生殖方式[8]。近年来应用Wolbachia改变害虫生殖遗传特征进而达到种群控制目的已引起广泛的关注[9,10]。多种寄生蜂中也存在Wolbachia，且它们大多数均与寄生蜂的雌性化和孤雌生殖特征有关[8]。显然，庞大的雌性种群是生物防治实践中可采取天敌淹没式释放的基础。利用Wolbachia诱导寄生蜂种群雌性化或产雌孤雌生殖，对寄生蜂的工厂化生产和生防效能提升均有重大意义。相关技术已在松毛虫赤眼蜂Trichogrammadendrolimi中得到应用[11-13]。

Wolbachia有强烈的环境温度依赖特征，其表达与宿主生存的环境温度密切相关。对卷蛾赤眼蜂T.cacoeciae、松毛虫赤眼蜂、食胚赤眼蜂T.embryophagum和丽蚜小蜂Encarsiaformosa的研究发现，宿主在高温条件下繁育会抑制体内Wolbachia的活性，甚至引起全部Wolbachia失活，并且均有显著的世代累积效应[14-17]。丽蝇蛹集金小蜂Nasoniavitripennis经30 ℃的热处理后，体内沃尔巴克氏体密度下降可达74%[18]。前期研究已经发现管氏肿腿蜂体内存在Wolbachia[19]。我们对实验室繁育的川硬皮肿腿蜂、白蜡吉丁肿腿蜂、松褐天牛肿腿蜂进行分子检测发现其均携带Wolbachia。在肿腿蜂工厂化繁殖中，为了能够在短时间内获得更多的天敌产品，往往会采取提高温度进而缩短肿腿蜂繁殖周期的办法。那么，在高温条件下繁育的肿腿蜂，其体内Wolbachia是否受到影响，或者什么样的温度条件会影响到肿腿蜂的Wolbachia携带率值得探索。另外，肿腿蜂是一类具有高度偏雌性比的寄生蜂，偏雌性比的形成机制目前还未得到解释。如果在高温条件下繁育的肿腿蜂其Wolbachia携带率下降，是否会引起偏雌性比特征的改变，一样值得我们研究。基于以上目的，本研究以川硬皮肿腿蜂为研究对象，通过设置不同的温度进行续代繁育，研究高温对川硬皮肿腿蜂生殖适合度的影响，同时评价高温对其体内Wolbachia携带率的影响。研究结果可为川硬皮肿腿蜂的繁育和利用提供参考，同时以期为揭示环境温度依赖的Wolbachia对寄生蜂生殖调控的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

川硬皮肿腿蜂由国家林业和草原局生物防治工程中心提供，实验室种群由麻天牛Thyestillagebleri幼虫作寄主续代繁殖得到，繁殖条件为25 ℃，RH 60%～70%，光周期8L:16D。经充分交配后的3 日龄雌蜂为本研究的供试蜂，供试寄主为体质量在200.0～250.0 mg 的麻天牛幼虫。

1.2 川硬皮肿腿蜂接种

将寄主单头装入玻璃指形管内（直径1.0 cm，高度5.0 cm）。在供试肿腿蜂中挑选个体大小相近的雌蜂，单头接入盛有寄主的指形管内并用脱脂棉塞紧管口。设置繁蜂温度为27 ℃、30 ℃和33 ℃，不同温度条件下湿度和光周期保持一致（RH 60%～70%，光周期8L:16D），每个温度条件下接种30 管。首次羽化得到的川硬皮肿腿蜂子代记为F1，在此种群中随机挑选个体大小相近的3 日龄雌蜂继续接种繁殖，羽化得到的子代记为F2，每个温度下仍接种30 管。重复上述接种过程，得到在不同温度条件下续代繁殖的F4肿腿蜂种群。参考项宇等[14]对卷蛾赤眼蜂的研究结果，发现在30 ℃条件下连续繁育5 代后即完全检测不到卷蛾赤眼蜂体内的Wolbachia。因此，本研究在获得不同温度下繁育得到的F4肿腿蜂种群后，用此种群做测定对象，用于对比研究其生殖适合度及Wolbachia携带率。

1.3 不同繁育温度下川硬皮肿腿蜂的生殖适合度

在27 ℃、30 ℃和33 ℃温度条件下繁育得到的F4中各随机选取30 头个体大小相近的3 日龄雌蜂，单头接种至1 头麻天牛幼虫，继续在3 组温度条件下繁育。记录母蜂对寄主的寄生能力差异，包括寄生率和子代羽化率，其中寄生率为被寄生的寄主数量占供试寄主总数的比例，子代羽化率为有子代蜂羽化的寄主数量占供试寄主总数的比例。记录母蜂产卵前期、子代蜂的发育历期和数量。产卵前期为接蜂至观察到第1 粒卵被产出的间隔期。子代蜂发育历期包括卵历期、幼虫历期、蛹历期和幼期历期。其中，卵历期为第1 粒卵产出至第1 头幼虫孵化的间隔期；幼虫历期为第1 头幼虫孵化至第1 个茧出现的间隔期；蛹历期为第1 个茧出现至第1 头成蜂羽化的间隔期；幼期历期为第1 粒卵产出至第1 头成蜂羽化的间隔时间。子代蜂发育历期均是每个接种的指形管内记录1 次数据，用于代表子代群体的发育进度。子代蜂完全羽化后，统计每头寄主上育得的雌蜂、雄蜂数量和雄性比。雄性比为1 头寄主上育得的雄蜂占子代总数的比例。以上均每日记录1 次。

1.4 Wolbachia 检测

在不同温度下繁育得到的F4中各随机选取30 头雌蜂（每管1～2 头），单头检测其是否携带Wolbachia。肿腿蜂基因组DNA 为单头提取，方法参照DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）试剂盒说明书。目标检测基因为wsp基因，通用引物为81F/691R[20]。PCR 扩增使用GoTaq® Green Master Mix（Promega）试剂，反应体系（25 μL）：GoTaq®Green Master Mix 2×为12.5 μL，正向和反向引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，Nuclease-Free Water 为9.5 μL。反应程序如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，30 个循环；72 ℃再延伸7 min。PCR 产物通过1%琼脂糖凝胶（含0.1‰的10×gel red）电泳分离后，凝胶成像系统检测是否有目标条带。每头待检川硬皮肿腿蜂的DNA 作模板，重复扩增3 次，均无条带视为不携带Wolbachia。统计不同温度下繁殖的肿腿蜂雌蜂的Wolbachia携带率差异。

1.5 数据统计与分析

Fisher’s 精确检验用于检验不同温度下川硬皮肿腿蜂的寄生能力差异，同时也用于检验经不同温度连续繁殖后，川硬皮肿腿蜂雌蜂Wolbachia的携带率。在不同温度下繁殖的川硬皮肿腿蜂的产卵前期、发育历期、子代数量和雄性比用单因素方差分析检验处理间差异，LSD 法进行多重比较。雄性比数据通过反正弦转化后符合正态分布和方差齐性，转化后的数据用于差异性检验。数据统计用SPSS 20 完成。

2 结果与分析

2.1 不同温度下川硬皮肿腿蜂的寄生能力

经不同温度连续繁育4 代后，川硬皮肿腿蜂寄生能力未发生显著改变。在27 ℃、30 ℃和33 ℃这3个温度条件下，雌蜂对麻天牛的寄生率均保持在90%以上，寄生率无显著差异（χ2＝2.944，df＝2，P＝0.363）。同时，在如上3 个温度条件下，川硬皮肿腿蜂子代羽化率仍无显著差异（χ2＝0.328，df＝2，P＝1.000），在27 ℃和33 ℃条件下子代羽化率均为90.00%，在30 ℃下子代羽化率为86.67%（表1）。

表1 不同温度下川硬皮肿腿蜂的寄生能力Table 1 Parasitism ability of S.sichuanensis rearing in different temperatures

2.2 不同温度下川硬皮肿腿蜂的产卵前期和子代历期

结果表明，在不同的繁育温度下，川硬皮肿腿蜂产卵前期存在显著差异（F＝5.239，df＝2, 82，P＝0.007）。当环境温度为27 ℃，平均产卵前期为4.63 d。当环境温度提升至30 ℃后，平均产卵前期显著延长，为5.37 d；当环境温度进一步增加时，其产卵前期无显著变化（图1）。由表2 可知，川硬皮肿腿蜂子代历期随繁育温度的升高而缩短。环境温度为27 ℃时平均卵历期为4.33 d，温度提升后卵历期显著缩短（F＝20.769，df＝2, 82，P＜0.001）。在27 ℃条件下川硬皮肿腿蜂幼虫平均需约7 d 才能发育至蛹，当温度提升到30 ℃时缩短至约6 d，提升至33 ℃时平均仅需约5 d，三者差异极显著（F＝23.239，df＝2,78，P＜0.001）。三组繁育温度下川硬皮肿腿蜂蛹历期均存在显著差异（F＝74.504，df＝2, 77，P＜0.001），温度升高至33 ℃时平均蛹历期较27 ℃下缩短了约3 d。总体上，繁育温度升高显著缩短了川硬皮肿腿蜂的幼期历期（F＝151.390，df＝2, 77，P＜0.001），在33 ℃时完成幼期发育较27 ℃和30 ℃分别提前了约5 d 和2 d。

图1 不同温度下川硬皮肿腿蜂的产卵前期Fig.1 The pre-oviposition period of S.sichuanensis rearing in different temperatures

表2 不同温度下川硬皮肿腿蜂的子代历期Table 2 The progeny developmental period of S.sichuanensis rearing in different temperatures

2.3 不同温度下川硬皮肿腿蜂的子代数量和雄性比

由表3 可知，繁育温度对川硬皮肿腿蜂子代雄蜂和雌蜂的数量均有显著影响，但对其子代总量影响不大。子代雄蜂数随繁育温度升高而逐渐增多，在三组温度下单雌平均产雄数分别为2.11 头（27 ℃）、3.73头（30 ℃）和7.63 头（33 ℃），存在显著差异（F＝4.837，df＝2,77，P＝0.010）。在30 ℃时川硬皮肿腿蜂单雌产雌数最多，平均为54.31 头；在33 ℃条件下单雌产雌数显著减少，平均为38.81 头（F＝3.384，df＝2,77，P＝0.039）。不同温度条件下，川硬皮肿腿蜂单雌子代总数分别为49.96 头（27 ℃）、58.04 头（30 ℃）和46.44 头（33 ℃），三者无显著差异（F＝1.919，df＝2,77，P＝0.154）。不同温度条件下，子代雄性比差异显著（F＝4.973，df＝2,77，P＝0.009）（图2）。子代雄性比随繁育温度升高逐渐增加；27 ℃时平均为5.01%，30 ℃增加到7.94%，33 ℃时显著增加到16.09%。

图2 川硬皮肿腿蜂在高温下各组子代雄性比的变化Fig.2 The male proportion of S.sichuanensis rearing in different temperatures

表3 不同温度下川硬皮肿腿蜂的子代数量Table 3 The progeny number of S.sichuanensis rearing in different temperatures

2.4 不同温度下川硬皮肿腿蜂雌蜂Wolbachia 携带率

在不同温度下连续繁育4 代后，川硬皮肿腿蜂雌蜂的Wolbachia携带率存在显著差异（χ2＝91.638，df＝3，P＜0.001），温度与携带率呈显著的负相关关系（表4）。在27 ℃条件下繁育4 代的川硬皮肿腿蜂雌蜂的Wolbachia携带率仍为100%；但当温度提升至30 ℃时，其携带率下降至50%。在33 ℃条件下繁育4 代后的川硬皮肿腿蜂雌蜂的Wolbachia携带率仅有6.67%。

表4 不同温度下川硬皮肿腿蜂Wolbachia 携带率Table 4 Wolbachia infection rate of S.sichuanensis rearing in different temperatures

3 讨论

环境温度是昆虫机体表现和生态成功的主要决定因素[21,22]。温度变化可影响机体的具体生物过程，包括行为、生长和发育速度、生殖力和生理代谢等[23-25]。对寄生蜂而言，其生长和发育过程受温度的影响往往较植食性昆虫更大，因为温度不仅直接影响寄生蜂个体的各项生物过程，还通过影响寄主昆虫的生长发育而间接影响寄生蜂的发育[26,27]。本研究发现，在27、30 和33 ℃三个温度条件下，川硬皮肿腿蜂雌蜂的寄生能力未发生显著改变，表明母蜂的寄生行为在该温度区间内表现无差异，未出现因高温致死母蜂情况的产生。同时，在不同温度条件下，可育出子代蜂的比例也无差异，表明此温度区间同样适宜川硬皮肿腿蜂幼期发育。对很多容性寄生蜂（寄生蜂产卵后寄主继续取食发育）而言，环境温度提升往往会对子代羽化产生负效应，这一结果主要是因为温度升高后寄主发育加快，可供寄生蜂繁育的特定寄主虫期缩短，进而影响子代蜂羽化[25,28]。川硬皮肿腿蜂属抑性寄生蜂，即母蜂在产卵前通过注射毒素麻痹寄主，在幼蜂发育过程中寄主不食不动。因此，温度对该寄生蜂的影响主要来自于对寄生蜂的直接作用，通过影响寄主进而间接影响寄生蜂发育的可能性较小。

本研究发现，温度对川硬皮肿腿蜂发育的直接影响主要体现在影响母蜂产卵前期、子代发育进度和子代数量三个方面。川硬皮寄生蜂是一种卵育型寄生蜂，雌蜂麻痹寄主后需取食寄主血淋巴补充营养，完成卵子发育。不同温度下产卵前期的长短即代表了该温度下母蜂卵成熟所需的时间。本研究发现，当温度为30 ℃或更高时，川硬皮肿腿蜂产卵前期较在27 ℃条件下更长。我们认为，虽然设置的3 组温度对母蜂寄生能力影响较小，但母蜂在27 ℃更容易完成补充营养和卵子成熟的过程，这可能与环境温度越高时母蜂自身机体能量消耗更大密切相关。相较于对川硬皮肿腿蜂母蜂寄生过程较小的影响外，温度显著地影响了子代幼蜂的发育进度。当环境温度升高时，子代蜂卵历期、幼虫历期、蛹历期和世代发育历期均呈显著缩短，33 ℃下幼期发育历期较27 ℃时缩短了约5 d。在升温条件下，寄生蜂的幼期历期并不是一味地缩短，如仓蛾圆柄姬蜂Venturiacanescens在15～30 ℃下发育历期随温度升高逐渐缩短，但超过30 ℃后发育历期反而延长[29]；绿眼赛茧蜂Zelechlorophthalmus随着温度升高发育历期变短，但当温度升至29 ℃后发育历期又比25 ℃条件下有所延长[30]。在本研究的试验温度范围内未出现川硬皮肿腿蜂发育历期随温度升高而延长的现象，可能和设置温度未达到其适宜发育温度的阈值有关，即33 ℃仍是川硬皮肿腿蜂的适宜发育条件，这一结果与前期发现当温度需升高至35 ℃时才不利于白蜡吉丁肿腿蜂寄生和发育的研究结论一致[6,31]。

在本研究的试验温度范围内，川硬皮肿腿蜂子代数量受温度影响不显著，但不同温度条件显著地影响了子代蜂的雌雄比例。川硬皮肿腿蜂单雌产雄数和子代雄性比随温度升高显著增加，33 ℃下的单雌产雄数和雄性比例较27 ℃时提升了近3 倍。多种硬皮肿腿蜂的自然性比是高度稳定的偏雌性，在母蜂数量、寄主大小和温度等条件变化时，偏雌性比会产生一定程度的偏移[5,6,32,33]。母蜂数量增大和寄主质量变差时，往往会产生更多的雄性后代。对于前者，其潜在原因可能是当仅有1 头母蜂时，子代幼蜂之间的资源竞争更弱，母蜂可以更多地产出雌性子代，这样即可在子一代就增加亲代的适合度。当有多头母蜂时，寄主资源受到限制，母蜂在这种情况下选择增加雄性后代比例，这些雄性后代可与其他母蜂的雌性后代交配，如此亲代适合度可在子二代实现最大化。对于寄主质量变差时子代雄性比例增加的潜在原因也是归因于上述的子代蜂资源竞争，而一般认为雄性完成发育所需的寄主资源较雌性更少，所以产雄是在寄主资源受限时的一种生殖权衡。

在温度升高时，肿腿蜂雄性比例为何增加当前还缺乏相关推论和假设。基于对在不同温度下连续繁育4 代后的川硬皮肿腿蜂雌蜂的Wolbachia携带率的检测，我们发现温度与携带率存在显著的负相关关系。在27 ℃条件下繁育4 代的川硬皮肿腿蜂Wolbachia携带率仍为100%，在33 ℃条件下繁育4 代后的川硬皮肿腿蜂Wolbachia携带率仅有6.67%。Wolbachia可诱导寄生蜂产雌孤雌生殖，且在未出现产雌孤雌生殖的寄生蜂中，Wolbachia侵染会增加寄生蜂的雌性比例[34-36]。本研究中用于测定生殖适合度的母蜂为在不同温度下续代繁殖4 代后的个体，即代表了它们在完成寄生行为前携带Wolbachia的比例不同。环境温度升高造成母蜂体内Wolbachia丰度降低或完全失活，进而影响了该菌在寄生蜂生殖中杀雄作用，最终造成雄性比例增多，可能是温度升高时川硬皮肿腿蜂雄性比增大的原因之一。此外，本研究发现在33 ℃下，经连续4 代繁殖，雌性川硬皮肿腿蜂的Wolbachia携带率就不足10%。这一结果预示着，高温作用下的世代累积效应也许可以完全去除其体内的Wolbachia，以此获得完全不携带该菌的种群。这一途径相较于通过饲喂抗生素来去除Wolbachia是极大的便利，为研究该菌对肿腿蜂生殖方式的调控机制提供了技术基础。但Wolbachia在肿腿蜂子代性别分配中的作用方式还需进一步研究。

以管氏肿腿蜂、川硬皮肿腿蜂、白蜡吉丁肿腿蜂和松褐天牛肿腿蜂为代表的肿腿蜂属寄生蜂是我国林业上广泛应用的天敌昆虫，每年都需释放数亿头肿腿蜂防治害虫[37]。淹没式天敌释放需要以强大的工厂化繁殖技术作保障。温度提升显然对缩短肿腿蜂的繁殖周期是有利的。然而我们的研究结果表明，温度升高会引起雄性后代的比例增多，而过多的雄蜂对生物防治是无效的。此外，若寄生蜂的Wolbachia能水平转移至害虫种群中，进而诱导害虫生殖细胞胞质不亲和而产生生殖能力缺陷的个体，对害虫种群的控制也是有益的。综上，我们认为繁育温度过高对川硬皮肿腿蜂生殖适合度是不利的，规模化繁育温度不宜超过30 ℃。