响应面法优化贝莱斯芽胞杆菌YC11的液体发酵培养基

刘 芳，黎妍妍，陈 伟，曹春霞，温少华，饶 犇*，黄大野*

（1.湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064；2.湖北省烟草科学研究院，武汉 430030）

烟草黑胫病又称烟草疫病，又称为黑根、黑秆疯、乌头病[1]。是由烟草疫霉Phytophthoraparasiticavar.nicotianae引起的一种广泛分布、毁灭性危害烟草的土传性真菌病害[2]。在中国已报道的烟草60 余种侵染性病害中，烟草黑胫病是中国烟草生产中危害严重的病害之一，每年因烟草黑胫病造成的产值损失多达1.23 亿元，仅次于烟草病毒病[3]。目前该病害的防治主要依靠化学杀菌剂，防治黑胫病当前使用较多的内吸性药剂主要有甲霜灵、烯酰吗啉、恶唑菌酮、恶霜灵等[4]。化学农药大量使用造成环境污染、生态平衡破坏以及病原菌对化学药剂产生抗药性[5-7]。生物防治具有相对安全、长效且不易使病原菌产生抗药性等特点，因此，开发环境友好型高效生防菌剂对烟草重要土传性病害进行生物防治，促进烟叶绿色生产具有重大意义[8]。

不同微生物有不同营养需求，进行微生物工业化大生产之前，需对其发酵培养基及培养条件进行小试优化。发酵培养基的优化方法，包括单因素试验[9,10]、正交设计[11-16]、均匀设计[17]、Plackett-Burman 设计[16-21]、Box-Behnken 设计[19,21]及中心组合设计[16,18,20,22]等，都可用在不同微生物发酵培养基及发酵条件优化中，而利用Plackett-Burman 设计、Box-Behnken 设计或中心组合设计，再结合响应面分析能够快速有效地确定其最佳培养基或培养条件。

本实验室从烟草根际土壤中分离到1 株贝莱斯芽胞杆菌BacillusvelezensisYC11，该菌株室内生测结果表明对烟草黑胫病具有良好防效，具有一定的微生物农药产品开发价值。本文以贝莱斯芽胞杆菌YC11为研究对象，对其产胞发酵培养基摇瓶配方进行Plackett-Burman 试验，筛选出显著影响因子，然后结合最陡爬坡试验、Box-Behnken（BB）响应面法拟合显著因子与芽胞产量的非线性方程求解，优化得到菌株最佳发酵产胞培养基摇瓶配方，并在500 L 罐中进行发酵验证，为该菌株的扩大生产及产业化提供支撑。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

贝莱斯芽胞杆菌YC11 由湖北省生物农药工程研究中心自主分离获得，并保存于武汉大学中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M20211651。

1.2 供试培养基

供试培养基配方如下：（1）LB 琼脂培养基：胰蛋白胨 10 g，氯化钠 5 g，酵母提取物5 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 L，pH 值7.0；（2）种子液培养基：不加琼脂的LB 液体培养基；（3）初始发酵培养基：淀粉15 g，豆粕20 g，硫酸镁0.3 g，磷酸二氢钾0.1 g，超纯水1 L，pH 值7.5，500 mL 三角瓶装液量为50 mL[18]；（4）摇瓶发酵培养基：按下文中PB、最陡爬坡、BB 试验设计要求配制，pH 值7.5，500 mL三角瓶装液量为50 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 摇瓶培养 斜面菌种YC11 30 ℃活化后，接种一环入装有100 mL LB 液体培养基的三角瓶（500 mL）中，30 ℃、180 r/min 培养16 h，作为摇瓶发酵的种子液。种子液按1%（v/v）接种量接至摇瓶发酵培养基中，30 ℃、180 r/min 培养至芽胞脱落20%时即发酵结束[18]。

1.3.2 发酵液芽胞产量的测定 发酵稀释液于80 ℃水浴20 min 杀死其中的营养体，再利用稀释涂布平板计数法测定[18]。

1.3.3 Plackett-Burman（PB）设计 以玉米粉为碳源，以鱼粉、酵母粉和玉米浆为氮源，硫酸镁及磷酸二氢钾为无机盐，共6 种营养因素（A：玉米粉，B：鱼粉，C：酵母粉，D：玉米浆，E：硫酸镁，F：磷酸二氢钾）进行Plackett-Burman 试验设计，6 因子2 水平的PB 试验因素水平表以及试验设计如表1 和表3所示，筛选影响菌株发酵芽胞产量的显著影响因子。

表1 PB 试验因素水平表Table 1 Factors and Levels of Plackett-Burman experiment

1.3.4 最陡爬坡试验 根据PB 试验所拟合方程的计算结果，以各显著因子为中心起点，确定最陡爬坡试验的方向与步长，通过爬坡试验来快速逼近中心点[23]。试验设计见表5。

1.3.5 Box-Behnken（BB）设计 根据最陡爬坡试验结果设计3 因素3 水平的BB 实验，每个因素设置低、中、高3 水平，分别以“-1”、“0”、“+1”代表[23]，以菌株发酵液芽胞产量为响应值Y，应用Minitab19软件拟合二次函数方程，根据拟合的数学模型以及方差分析的结果，分析单独因子及因子之间交互作用对响应值Y 的影响，绘制响应面分析曲面图和等值线图直观地描绘其结果，同时利用拟合二次函数方程解析出最优结果，因素水平及试验设计见表2 和表6。

We got home at midnight.By that time everyone else was in bed.

表2 BB 试验因素水平表Table 2 Factors and level design of Box-Behnken experiment

1.3.6 摇瓶发酵验证试验 优化后的培养基配方按比例配制培养基进行摇瓶发酵，设3 个平行重复，温度30 ℃、摇床转速180 r/min 培养条件下培养至芽胞脱落20%。发酵结束后按1.3.2 方法，测定发酵液的芽胞产量。

1.3.7 500 L 发酵罐发酵验证 斜面菌种30 ℃活化后，分别接种一环入30 瓶LB 液体培养基中，温度30 ℃、摇床转速180 r/min 条件下培养16 h 后合瓶，作为发酵罐的种子备用。按优化后的培养基配方称取培养基，60%投料体积计料，消泡剂300 mL，121 ℃～123 ℃，1×105Pa 条件下保温保压灭菌30min。待罐温降至32 ℃时压差法接入1%（v/v）的种子液，通气比1：0.5～1.2，罐压0.5×105Pa，培养温度30 ℃～32 ℃，搅拌常开，发酵24 h 后每隔2 h 取样镜检，以芽胞脱落分离20%时为发酵终点，停止发酵，测定发酵液的芽胞产量。

1.3.8 贝莱斯芽胞杆菌YC11 优化发酵培养物对烟草黑胫病的防控效果 将烟草种子（云烟87）播种于装有基质（草炭:蛭石3:1）育苗钵中，待生长至5～6 叶期备用。取上述优化后的发酵液，使用原液和稀释5 倍发酵液进行灌根，对照药剂为50%烯酰吗啉可湿性粉剂（巴斯夫欧洲公司），稀释500 倍。灌根量均为20mL/株，对照灌清水。每个处理3 次重复，每个重复15 株。24 h 后灌烟草疫霉孢子悬浮液（1×106孢子/mL），按照张潜等[24]方法制备孢子悬浮液。待对照充分发病统计病情指数，并计算防效。

烟草根茎病害分级标准参照《中华人民共和国国家标准农药田间药效实验准则（二）GB/T 23222-2008》进行。烟草黑胫病分级标准：0 级，全株无病；1 级，茎部病斑不超过茎围的1/3，或1/3 以下叶片凋萎；3级，茎部病斑环绕茎围1/3～1/2，或1/3～/2 叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑；5 级，茎部病斑超过茎围的1/2，但未全部环绕茎围，或1/2～2/3 叶片凋萎；7 级，茎部病斑全部环绕茎围，或2/3 以上叶片凋萎；9 级：病株基本枯死[25]。病情指数=∑（各级植株数×级别）/（调查总株数×最高代表级别）×100。防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100。

1.4 数据统计与分析

上述PB 试验、BB 试验及响应面分析均利用Minitab19 软件进行设计和分析及绘图。试验结果利用SPSS 22.0 软件进行统计分析，采用最小显著差异法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman 试验结果

Plackett-Burman 试验结果与方差分析如表3 和表4 所示，应用Minitab19 软件分析可以得到各营养因子与响应值Y（发酵液芽胞产量）的一次回归方程为：Y=62.65－16.08A-5.65B+9.22C－1.72D+14.18E+2.68F；培养基成份中的玉米粉（A）、酵母粉（C）和硫酸镁（E）为显著影响因子，玉米粉（A）系数为负数，说明其与响应值Y（发酵液芽胞产量）负相关，酵母粉（C）和硫酸镁（E）系数为正数，说明它们与响应值Y（发酵液芽胞产量）正相关，决定系数R2=0.9151，表明模型线性方程能够解释91.51%的原因，仅8.49%的变异不能由此模型解释，校正决定系数Adj R2=0.8133，表明模型可解释81.33%的变异。

表3 六因素PB 试验设计及结果Table 3 The design and result of Plackett-Burman experiment with 6 factors

表4 PB 试验方差分析结果Table 4 Analysis of variance and results of Plackett-Burman experiment

2.2 最陡爬坡试验结果与分析

对PB 试验结果分析得到的玉米粉（A）、酵母粉（C）、硫酸镁（E）三个显著因子进行最陡爬坡实验，选择PB 设计中三个因素的中间水平，即玉米粉25.00 g/L、酵母粉10.00 g/L、硫酸镁0.38 g/L 为初始起点，最陡爬坡试验结果见表5。响应值Y（发酵液芽胞产量）最高值出现在处理3，选择处理3 的条件作为下一步Box-Behnken（BB）试验设计各因素水平的中心点，即玉米粉15.00 g/L、酵母粉15.00 g/L 和硫酸镁0.62 g/L。

表5 最陡爬坡试验设计表Table 5 Design of steepest ascent experiment

2.3 Box-Behnken (BB)试验结果与分析

BB 试验结果与方差分析如表6 和表7 所示，回归模型P=0.004（＜0.01）显著性较高，模型多元相关性系数R2=0.9646，说明只有3.54%的变异不能由此模型解释，失拟项P值为 0.236（＞0.05）影响不显著，说明模型不存在失拟现象。并且模型线性P值=0.004（＜0.01）影响显著、平方的影响P值=0.002（＜0.01）影响显著，双因子之间交互作用P值为0.595（＞0.05）影响不显著。以YC11 摇瓶发酵液芽胞产量（Y）为因变量，玉米粉（A）、酵母粉（C）和硫酸镁（E）添加浓度为自变量，应用Minitab19 软件拟合得到非线性回归方程：Y=113.33-5.625A+1.675C-1.300E-10.77A2-2.87C2-1.92 E2-0.10AC-1.65 AE+0.35CE。

表6 3 因素BB 试验设计及结果Table 6 The design and results of Box-Behnken experiment

表7 BB 试验方差分析结果Table 7 Analysis of variance of the results of Box-Behnken experiment

利用Minitab 19 软件对回归模型进行响应面分析，绘制响应面分析曲面图和等值线图（图1）。由图及软件可直观分析出此模型具有最大值，运用Minitab 19 软件响应优化器计算得到，各显著营养因子在发酵培养基中最佳浓度为：玉米粉13.74 g/L、酵母粉15.73 g/L 和硫酸镁0.59 g/L，在此条件下理论预测YC11菌株的芽胞产量可达114.4×108cfu/mL。

图1 芽胞杆菌YC11 芽胞产量与不同营养成份的响应面优化Fig.1 Response surface optimization of the spore production by YC11 strain with different nutrients

2.4 最优培养基的摇瓶发酵验证

YC11 菌株在上述优化培养基中进行了3 次重复摇瓶发酵验证。发酵液芽胞产量平均值为（116.6±2.1）×108cfu/mL，与预测值（114.4×108cfu/mL）相当，较优化前芽胞产量（70.8±3.1×108cfu/mL）提高了64.7%。

2.5 500 L 发酵罐发酵验证

贝莱斯芽胞杆菌YC11 菌株在500 L 罐发酵验证中，发酵28 h 取样涂片镜检，芽胞形成率为98%，菌体大小整齐。发酵38 h 取样涂片镜检，约20%芽胞脱落，且芽胞整齐，未发现营养体。28 与38 h 镜检图片见图2 和图3。停止发酵，测得发酵液芽胞产量为（150.2±3.9）×108cfu/mL，较摇瓶发酵提升了25%以上。

图2 500 L 发酵罐28 h 培养物镜检Fig.2 Microscopic examination of fermentation culture of YC11 in 500-L fermenter 28 h after inoculation

图3 500 L 发酵罐38 h 培养物镜检Fig.3 Microscopic examination of fermentation culture of YC11 in 500-L fermenter 38 h after inoculation

2.6 YC11 发酵液对烟草黑胫病防效

盆栽试验结果表明，YC11 发酵液对烟草黑胫病具有良好的防控效果，能有效降低病情指数。YC11发酵原液和5 倍发酵稀释液对烟草黑胫病防效分别为100%和84.06%，其中原液防效显著高于对照药剂烯酰吗啉（表8）。

3 讨论

通过优化发酵培养基的组成提高微生物菌株的发酵水平，是芽胞杆菌生防菌剂产业化开发中的一项重要工作。响应面实验是优化培养基配方、培养条件及发酵参数等普遍采用的方法[18,20,22,26]。一般培养基的优化多基于芽胞或活菌的产量[15,18]、发酵液的抑菌活性[14,19,22,26]或目标产物的产量[20]进行优化。由于目前基于芽胞杆菌的生物杀菌剂多以芽胞数作为质量控制指标，因此，在开展本研究时，以发酵液芽胞产量作为考核指标对摇瓶发酵培养基进行优化。

前人有关贝莱斯芽胞杆菌培养基优化的研究多集中于采用可溶性培养基成分。一株抗金银花白粉病菌贝莱斯芽孢杆菌HC-8 更喜好蛋白胨、麦芽糖及酵母膏[11]，而抗烟草花叶病毒的贝莱斯芽胞杆菌Z5 菌株的最适碳源和氮源分别为葡萄糖和酵母膏[27]。而对烟草黑胫病菌具有拮抗活性的贝莱斯芽胞杆菌MC2-1菌株的最适培养基成分为牛肉浸膏、酵母浸粉及麦芽糖[13]。采用农副产品，成本较低，易于获得，易于后续的产业化开发。本文对从茶园分离的贝莱斯芽胞杆菌CY30 的发酵培养基优化的结果表明，甘薯粉及酵母膏对其芽胞的形成影响最大[18]。本研究中，对YC11 菌株芽胞产量影响最为显著的营养成分为玉米粉、酵母粉和硫酸镁，说明即使是同一种芽胞杆菌的不同分离株的营养需求也存在差异。

不同的贝莱斯芽胞杆菌菌株产胞水平存在较大的差异。在本研究中，仅对YC11 菌株的发酵培养基进行了优化，使该菌株的芽胞产量达到了116.6 亿芽胞/mL，而进一步在500 L 发酵罐中验证，发酵水平达到了150 亿芽胞/mL 以上。李姝江等[26]通过优化发酵参数，使ZJ20 菌株在可溶性培养基的产芽胞水平达到了76.9 亿芽胞/mL。而贝莱斯芽胞杆菌CY30 菌株在优化培养基中的产芽胞水平为97.5 亿芽胞/mL[18]。由于不同研究者所用的菌株的研发目的不同，而且所选择的培养基的成分也不相同，很难比较不同菌株之间的发酵水平及活性差异。但在多项以可溶性营养成分进行培养基优化的研究中，不同贝莱斯芽胞杆菌菌株的产芽胞水平相对较低[15,21,26]，是否与可溶性营养成分含量较低有关还需深入研究。