贝莱斯芽胞杆菌YL2021高产嗜铁素的摇瓶发酵工艺优化

沈佳慧，乔俊卿，左 杨，刘永锋，刘邮洲*

（1.南京农业大学植物保护学院，南京 210095；2.江苏省农业科学院植物保护研究所，南京 210014）

嗜铁素是生物体在长期进化过程中应对低铁环境条件下获取铁元素所分泌的一种小分子量的螯合因子，与Fe3+的结合能力非常强（生成常数可达1023～1052），且具有特异性[1]。目前，国内外报道的嗜铁素种类已超过500 种[2]。按照对 Fe3+的螯合基团不同，嗜铁素可分为4 类：儿茶酚型（catecholate）嗜铁素、异羟肟酸型（hydroxamate）嗜铁素、羧酸盐型（carboxylate）嗜铁素及混合型嗜铁素[3]。

多数芽胞杆菌，如炭疽芽胞杆菌Bacillusanthracis、苏云金芽胞杆菌B.thuringiensis、蜡质芽胞杆菌B.cereus、解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens等[4-6]，能分泌儿茶酚型嗜铁素bacillibactin。Bacillibactin最早是从枯草芽胞杆菌B.subtilis发酵培养液中分离获得的[7]，由3 个组合单元[甘氨酸+苏氨酸+二羟基苯甲酸（dihydroxybenzoate，DHB）]环化形成。此外，部分芽胞杆菌还可以分泌产生羧酸型嗜铁素pertrobactin[5,6]。贝莱斯芽胞杆菌B.velezensisYL2021 是一株对多种病原菌均有良好防治效果的生防菌，其基因组中含有完整的儿茶酚型嗜铁素合成基因簇。前期试验结果表明，菌株YL2021 缺铁条件下能产生具有抑菌作用的儿茶酚型嗜铁素[8]。

目前，响应曲面法（response surface methodology，RSM）广泛应用于微生物发酵工艺优化，是一种可以在多因子系统中拟合因子和响应值之间全局函数关系的数学统计方法[9]。为了提高贝莱斯芽胞杆菌YL2021 嗜铁素的产量，本研究首先通过比较8 种常见的发酵培养基对菌株YL2021 产生嗜铁素的影响，筛选出菌株YL2021 产嗜铁素的最佳基础培养基，随后采用Plackett-Burman（PB）试验、中心组合试验（central composite design，CCD）和响应曲面法（RSM），对影响菌株YL2021 高产嗜铁素的培养基成分和培养条件进行优化，以期获得更高的嗜铁素产量，为嗜铁素的高效发酵和产业化应用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 拮抗细菌-贝莱斯芽胞杆菌 YL2021 由本实验室保存并提供。供试细菌-水稻白叶枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzaePXO99 和欧文氏菌Erwiniaamylovora2029 由本实验室保存并提供；供试真菌-稻瘟病菌MagnaporthegriseaGuy11 由南京农业大学惠赠，水稻纹枯病菌RhizoctoniasolaniRH-2 由本实验室保存并提供。

1.1.2 培养基及营养液 拮抗细菌的8 种培养基为 ① Luria-Bertani (LB) 培养基：胰蛋白胨10.00 g、酵母提取物5.00 g、NaCl 10.00 g、水1000 mL；② 营养肉汤培养基(Nutrient Broth, NB)：牛肉膏3.00g、蛋白胨 10.00 g、NaC1 5.00 g、水1000 mL，pH 值7.0；③ 1/2 胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基(Trypticase Soy Broth,TSB)：胰酪大豆胨培养基粉15.00 g、水1000 mL；④ 丁二酸培养基(Succinic acid medium, (SM))[10]：KH2PO43.00 g、K2HPO46.00 g、MgSO4·7H2O 0.10 g、(NH4)2SO41.00 g、丁二酸4.00 g、水1000 mL，pH 值7.0；⑤ 丁二酸钠(NaSM)培养基[10]：KH2PO43.00 g、K2HPO46.00 g、MgSO4·7H2O 0.10 g、(NH4)2SO41.00 g、丁二酸钠 4.00 g、水1000 mL；⑥ M9 基础培养基(M9 Minimal Medium)[11]：配置10×M9 盐溶液：Na2HPO460.00 g、KH2PO430.00 g、NaCl 5.00 g、NH4Cl 10.00 g，水1000 mL，pH 7.4，灭菌备用。1 mol/L MgSO4溶液：MgSO4·7H2O 2.46 g，水10 mL，灭菌备用。1 mol/L CaCl2溶液：CaCl21.11 g，水10 mL，灭菌备用。40%葡萄糖溶液：葡萄糖 8.00 g，蒸馏水20 mL，0.22 微米滤器过滤除菌。无菌操作配制M9 培养基：10×M9盐溶液100 mL、1 mol/L MgSO4溶液 2 mL、1 mol/L CaCl2溶液0.1 mL、40%葡萄糖溶液5 ml、加水至1000 mL；⑦ MSA 培养基[12]：蔗糖 20.00 g、天冬氨酸 2.00 g、K2HPO41.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、水1000 mL；⑧ MKB 培养基[13]：酪蛋白氨基酸 5.00 g、K2HPO42.50 g、MgSO4·7H2O 2.50 g、甘油15.00 mL、水1000 mL。

1.1.3 拮抗细菌种子液的制备 挑取拮抗细菌YL2021 的新鲜菌苔接种于100 mL LB 液体培养基中，28 ℃、150 r/min 摇培至OD600值1.0 时，10000 r/min 离心10 min 后，菌泥用无菌水稀释至菌含量108CFU/mL，得到拮抗菌种子液，备用。

1.2 儿茶酚型嗜铁素产量的测定

参考文献[14]，不同浓度梯度的2,3-DHB 标准品（分析纯，上海生工生物有限公司）发生Arnow 反应：吸取液体1 mL，依次加入1 mL 0.5 mol/L HCl，1 mL 钼酸盐溶液和1 mL 1 mol/L 的NaOH，溶液颜色变红，并保持15 min 不变色，用分光光度计检测反应液在510 nm 处的光度值，绘制标准曲线，获得回归方程。试验重复3 次。将1.1.3 种子液以1:100 比例转接至100 mL 培养基中，28 ℃、150 r/min 摇培48 h。取2 mL发酵液10000 r/min 离心10 min，吸取1 mL 上清液发生Arnow 反应，检测OD510值。根据2,3-DHB 标准品的线性回归方程，计算发酵液中嗜铁素产量。

1.3 菌株YL2021 高产嗜铁素发酵培养基及其配方的优化筛选试验

1.3.1 基础培养基的筛选 将1.1.3 种子液以1:100 比例转接8 种培养基中，28 ℃、150 r/min 摇瓶培养48 h后，取2 mL 菌液10000 r/min 离心10 min，吸取1 mL 上清液，检测其中嗜铁素含量，筛选最佳的基础培养基。试验重复3 次。

1.3.2 发酵培养基单因素筛选试验 保持基础培养基中其他组分不变，开展用蔗糖、甘油、柠檬酸钠、水溶性淀粉和麦芽糖替换基础培养基中的碳源；用蛋白胨、(NH4)2SO4、酵母膏、尿素和黄豆饼粉替换基础培养基中的氮源；在基础培养基中分别添加甘氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸钠；逐一去除基础培养基中金属盐离子等单因素筛选试验。种子液以1:100 比例转接不同培养基中，28 ℃，150 r/min 摇培48 h 后，取2 mL 菌液10000 r/min 离心10 min，吸取1 mL 上清液，检测其中嗜铁素含量，筛选菌株YL2021 产生嗜铁素的最佳碳源、氮源、氨基酸和金属盐离子。试验重复2 次。

1.3.3 培养基成分关键因子PB 试验与最陡爬坡试验 根据1.2.2 部分单因素筛选试验结果，采用Design Expert 8.0 软件设计PB 试验，从以下6 个因素中筛选影响嗜铁素产量的关键因子，试验中每因素取“1”（高水平，范围区间最大值）和“-1”（低水平，范围区间最小值）两水平，即葡萄糖2.50 和17.50 g/L（A），NH4Cl 0.50 和3.50 g/L（B），谷氨酸钠1.00 和11.00 g/L（C），KH2PO40.50 和7.50 g/L（D），MgSO40.50 和3.00 g/L（E），CaCl20.01 和0.14 g/L（F）。试验重复 3 次。

根据PB 试验结果，综合选出3 个对嗜铁素产量有显著影响的培养基关键因子：葡萄糖（A）、NH4Cl（B）和KH2PO4（D）。采用最陡爬坡试验对3 个关键因素的用量范围进行摸索，确定合适的步长，为后续的中心组合试验提供依据。试验重复3 次。

1.3.4 培养基成分关键因子中心组合试验（CCD）设计 根据PB 试验和最陡爬坡试验结果，利用中心组合试验对葡萄糖、NH4Cl 和KH2PO4进行3 因素5 水平试验，依据其设计原理，分别按照轴向点α值为1.682，角点值为1，设计5 水平试验（表 1），共设20 组。试验重复3 次。对培养基成分关键因子进行响应曲面分析，获得培养基成分关键因子的最优组合。

1.4 菌株YL2021 高产嗜铁素培养条件的优化筛选试验

1.4.1 培养条件关键因子PB 试验与最陡爬坡试验 以优化后的培养基为研究对象，采用Design Expert 8.0软件设计PB 试验，从温度、pH、转速、接种量、装液量以及培养时间6 个因素中筛选影响嗜铁素产量的培养条件关键因子，试验中每因素取“1”（高水平，范围区间最大值）和“-1”（低水平，范围区间最小值）两水平，即pH 值6.0 和8.0（A），温度25 ℃和33 ℃（B），转速150 和220 r/min（C），装液量25 和125 mL（250 mL 三角瓶中）（D），接种量0.5%和3.0%（E），培养时间24 和 48 h（F）。试验重复3 次。

根据PB 试验结果，综合选出3 个对嗜铁素产量有显著影响的培养条件关键因子：pH 值（A）、接种量（E）和培养时间（F）。采用最陡爬坡试验对3 个关键因素的范围进行摸索，确定合适的步长，为后续的中心组合试验提供依据。试验重复3 次。

1.4.2 培养条件关键因子中心组合（CCD）试验 根据PB 试验和最陡爬坡试验结果，利用中心组合试验对pH 值、接种量和培养时间进行3 因素5 水平试验，依据其设计原理，分别按照轴向点α值为1.682，角点值为1，设计5 水平试验（表2），共设20 组。试验重复3 次。对培养条件关键因子进行响应曲面分析，获得培养条件关键因子的最优组合。

1.5 摇瓶发酵验证试验

根据响应曲面优化结果，将种子液转接至优化培养基中，按优化后的培养条件进行振荡摇培。取2 mL菌液10000 r/min 离心10 min，吸取1 mL 上清液，检测OD510值，计算嗜铁素产量。

1.6 嗜铁素的室内抑菌试验

优化后菌株YL2021 发酵液中嗜铁素的提取见参考文献[8]，获得嗜铁素粗提液。

稻瘟病菌Guy11 和水稻纹枯病菌RH-2 在PDA 平板28 ℃培养2～7 d 后，沿菌落边缘用直径5 mm 打孔器打孔，将菌块置于PDA 平板中央。培养皿四周呈“十”字形（距培养皿中心 30 mm）打孔，孔径为5 mm。孔内分别滴加清水对照10 μL、空白培养基对照10 μL、嗜铁素粗提液5 和10 μL 共计4 个处理。每处理重复3 皿。28 ℃恒温培养，待清水对照处理病原菌菌落长满平板时测量各处理菌落生长情况。

欧文氏菌2029 和水稻白叶枯病菌PXO99 用LB 培养液28 ℃、150 r/mim 振荡培养48 h，用无菌水稀释至2.0×108cfu/mL，备用。分别吸取清水对照 10 μL、空白培养基对照10 μL、嗜铁素粗提液5 和10 μL，点接在M9 平板中央，吹干。供试细菌-欧文氏菌和水稻白叶枯病菌稀释液均匀喷雾平板1 秒，约100 μL，28 ℃培养过夜，测定抑菌圈直径。每处理重复3 次，取平均值。

1.7 数据统计与分析

上述PB 试验、CCD 试验及响应面分析均利用Design Expert 8.0 软件进行设计和分析。用Excel 2010和DPS 数据处理系统7.05 软件进行统计分析，采用邓肯氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 2,3-DHB 标准曲线的建立

试验结果表明，2,3-DHB标准曲线的线性方程为y=0.0014x+0.0802，R2=0.9817；2,3-DHB浓度100～700 μmol/L与其Arnow 反应后的OD510值呈良好的线性关系（图1）。因此，菌株YL2021 发酵上清液Arnow 反应后测定OD510值，依据上述方程可以计算出发酵液中儿茶酚型嗜铁素产量。

图1 建立2,3-DHB 标准曲线Fig.1 The standard cruve of the 2,3-DHB

2.2 确定发酵基础培养基

8 种候选培养基中，菌株YL2021 在M9 液体培养基中OD510数值最高，达到0.141，表明该培养条件下嗜铁素产量较高；其次是MSA 培养基，OD510为0.135；以每升培养基的成本进行核算，M9 培养基成本约1.32 元，而MSA 培养基成本约4.06 元。菌株YL2021 在LB、NB、1/2 TSB、SM、NaSM 和MKB液体培养基中OD510数值较低，表明其产生的儿茶酚型嗜铁素较少。因此，基于嗜铁素产量和经济成本综合考虑，选择M9 培养基作为菌株YL2021 产生嗜铁素的基础培养基（图2）。

图2 贝莱斯芽胞杆菌YL2021 高产嗜铁素的基础培养基筛选Fig.2 Screening of basal culture medium for siderophore production of B.velezensis YL2021

2.3 发酵培养基成分优化筛选试验

菌株YL2021 在添加甘油为碳源的M9 液体培养基中嗜铁素产量最高，OD510值为0.280；其次为M9培养基中碳源-葡萄糖，OD510值为0.203。基于经济成本考虑，继续选择葡萄糖为碳源进一步优化。菌株YL2021 在添加尿素为氮源的M9 液体培养基中嗜铁素产量最高，OD510值为0.247；其次为M9 培养基中氮源-NH4Cl，OD510值为0.203。基于经济成本考虑，继续选择以M9 培养基中的NH4Cl 作为氮源进一步优化。M9 液体培养基中添加谷氨酰胺和苏氨酸时，菌株YL2021 产生的嗜铁素较多，OD510值均为0.232；其次为谷氨酸钠，OD510值为0.218。基于经济成本考虑，选择谷氨酸钠进行下一步优化。M9 液体培养基中金属离子KH2PO4、MgSO4和CaCl2不能去除，否则会直接影响菌株YL2021 嗜铁素产量；而M9 液体培养基中去除NaCl，菌株YL2021 嗜铁素产量基本不影响，OD510值为0.201，与去除前无差异。有趣的是，M9 液体培养基中去除Na2HPO4有利于菌株YL2021 产生嗜铁素，OD510值可达0.502，嗜铁素产量明显增加（图3）。因此，在M9 液体培养基的基础上去除Na2HPO4和NaCl 进行下一步的优化。

图3 贝莱斯芽胞杆菌YL2021 高产嗜铁素的培养基成分单因素筛选Fig.3 Single-factor screening of culture medium components for siderophore production of B.velezensis YL2021

2.4 培养基成分关键因子PB 试验与最陡爬坡试验

基于单因素试验结果，选取6 个培养基组分开展PB 试验，共设计12 组培养基，发酵液OD510值见表3。将试验结果利用Design Expert 8.0 软件进行回归分析和方差统计分析，所得各因子的回归方程为：Y=0.38+0.010A－0.076B+0.011C+0.11D+0.007E+0.011F，校正系数R2=0.8714，式中Y代表OD510预测值。方差分析结果表明（表4）：回归模型P值为0.0386，在0.05 水平上显著，葡萄糖（A）、NH4Cl（B）和KH2PO4（D）三个因子的变化显著影响菌株YL2021 嗜铁素产量（P＜0.05），其中KH2PO4（D）的影响最为显著，P值为0.0120。因此，选择葡萄糖、NH4Cl、KH2PO4三个因子作为培养基成分中影响菌株YL2021嗜铁素产量的关键因子。

最陡爬坡试验设计与结果见表5。当葡萄糖、NH4Cl 和KH2PO4的用量分别为19.00、2.00 和6.50 g/L时，发酵液OD510值达到最高值0.769，即菌株YL2021 嗜铁素产量达到最大，表明该组合的变量水平已接近最佳用量，可作为中心组合试验的中心值进行试验。

2.5 培养基成分关键因子的中心组合实验及响应面分析

在PB 试验和最陡爬坡试验的基础上，设计中心组合试验以确定各因素最佳用量，试验设计及结果见表6。采用Design Expert 8.0 软件对试验结果进行回归分析，获得回归方程为：Y=0.78+0.011A+0.033B+0.036C－0.023AB－0.009AC－0.051BC－0.041A2－0.038B2－0.027C2，校正系数R2=0.9380，式中Y是OD510预测值，A、B 和C 分别是葡萄糖、NH4Cl 以及K2HPO4。方差分析结果见表7，模型的P值＜0.0001，表明该模型正确可靠，菌株YL2021 发酵液OD510实际测定值与方程预测值存在显著相关性。该模型变异系数CV 为2.69 %(＜10 % )，属于弱变异，进一步表明试验数据的可靠性。响应面分析可知，回归模型可以确定3 个因素的最佳中心点，即3 个变量的最优值：葡萄糖19.43 g/L、NH4Cl 1.93 g/L 以及KH2PO49.02 g/L时，OD510预测值为0.794，菌株YL2021 嗜铁素产量为509.86 μmol/mL。

响应面分析结果见图4。葡萄糖和NH4Cl 两因素交互作用的P值为0.0060，在0.05 水平上交互作用显著，葡萄糖和KH2PO4两因素交互作用的P值为0.2050，在0.05 水平上交互作用不显著，NH4Cl 和KH2PO4两因素交互作用的P值＜0.0001，在0.05 水平上交互作用显著。

图4 葡萄糖和NH4Cl（A）、葡萄糖和KH2PO4（B）、NH4Cl 和KH2PO4（C）的响应曲面分析Fig.4 Response surface curves showing the interface of glucose, NH4Cl and KH2PO4

2.6 培养条件关键因子PB 试验与最陡爬坡试验

基于优化后的培养基，采用PB 试验从温度、pH、接种量、装液量、培养时间、转速6 个因素中筛选对菌株YL2021 嗜铁素产量具有显著影响的培养条件关键因子。试验设计及结果见表8。将试验结果利用Design Expert 8.0 软件进行回归分析和方差统计分析，获得回归方程为：Y=0.82+0.14A－0.052B+0.086C－0.023D+0.19E+0.12F，校正系数R2=0.9346，式中Y为OD510值。由校正系数可知Y的变化中 93.46%能被回归方程解释。方差分析结果表明（表9）：回归模型P值为0.0078，在0.05 水平上显著，pH 值（A）、接种量（E）和培养时间（F）三个因子的变化显著影响菌株YL2021 嗜铁素产量（P＜0.05）。因此，在后续的中心组合试验中将pH 值、接种量和培养时间作为研究对象进行进一步优化。

最陡爬坡试验设计与结果见表10。当pH 值为7.5、接种量为2.0%和培养时间30 h 时，发酵液OD510值达到最高值1.063，表明该组合的变量水平已接近最佳用量，可作为中心组合试验的中心值进行试验。

表1 培养基成分关键因子中心组合实验各因素水平Table 1 Central composite experimental design of key media composition

表2 培养条件关键因子中心组合实验各因素水平Table 2 Central composite experimental design of key culture condition

表3 培养基成分关键因子Plackett-Burman 试验设计及结果Table 3 Experimental design and response of Plackett-Burman design of media compositions

表4 培养基成分关键因子Plackett-Burman 试验方差分析Table 4 Analysis of variance for Plackett-Burman design of media compositions

表5 培养基成分关键因子最陡爬坡试验设计及结果Table 5 The design and results of the steepest climbing path experiments for key component of medium

表6 培养基成分关键因子中心组合试验及结果Table 6 The design and results of central composite experiments for key component of medium

表7 培养基关键因子中心组合试验回归方程的方差分析Table 7 The variance analysis of regression equation from central composite experiments of key component of medium

表8 培养条件关键因子Plackett-Burman 试验设计及结果Table 8 Experimental design and response of Plackett-Burman design of culture conditions

表9 培养条件关键因子Plackett-Burman 试验方差分析Table 9 Analysis of variance for Plackett-Burman design of culture conditions

表10 培养条件关键因子最陡爬坡试验设计及结果Table 10 The design and results of the steepest climbing path for culture condition

2.7 培养条件关键因子中心组合试验及响应曲面分析

中心组合试验和结果见表11。采用Design Expert 8.0 软件对试验结果进行回归分析，获得主回归方程为：Y=0.95－0.045A+0.170B+0.078C+0.0036AB－0.014AC－0.074BC－0.1A2－0.047B2－0.084C2，校正系数R2=0.9375，式中Y为OD510预测值，A、B 和C 分别是pH 值、接种量和培养时间。方差分析结果见表12，模型的P值＜0.0001，表明该模型正确可靠，菌株YL2021 发酵液OD510实际测定值与方程预测值存在显著相关性。由响应面分析可知，回归模型可以确定3 个因素的最佳中心点，即3 个变量的最优值，分别为pH 值7.0、接种量5%以及培养时间36.5 h，OD510预测值为1.079，此时菌株YL2021 的嗜铁素产量最高，为713.43 μmol/mL。

表11 培养条件关键因子中心组合试验及结果Table 11 The design and results of central composite experiments for culture condition

表12 培养条件关键因子中心组合试验回归方程的方差分析Table 12 The variance analysis of regression equation from central composite experiments of key culture condition

响应面分析结果见图5。接种量和培养时间两因素交互作用的P值为0.0024，在0.05 水平上交互作用显著，pH 值和接种量两因素交互作用的P值为0.8495，在0.05 水平上交互作用不显著，pH 值和培养时间两因素交互作用的P值为0.4776，在0.05 水平上交互作用亦不显著。

图5 pH 值和接种量（A）、pH 值和培养时间（B）、接种量和培养时间（C）的响应曲面分析Fig.5 Response surface curves showing the interface of pH value, inoculating volume and culture time

2.8 摇瓶发酵验证

以初始发酵培养基和培养条件作对照，对优化后的培养基及培养条件进行摇瓶验证。结果表明：无论是优化前还是优化后，菌株YL2021 发酵液OD510实测值与模型预测值在0.05 水平上均无显著差异，验证了该模型具有较高的拟合性。培养基成分及培养条件优化前，菌株YL2021 发酵液OD510实测值为0.141±0.018，对应的儿茶酚型嗜铁素产量为64.81 μmol/L；优化后，菌株YL2021 发酵液OD510实测值为1.109±0.023，对应的嗜铁素产量为734.86 μmol/L，嗜铁素产量提高了10.34 倍，优化效果良好。

2.9 嗜铁素粗提物的室内抑菌作用

嗜铁素粗提物对稻瘟病菌和水稻纹枯病菌的平板对峙生长抑制试验结果见图6。清水和空白培养基均无抑制作用，而菌株YL2021 嗜铁素粗提液对稻瘟病菌和水稻纹枯病菌生长均具有抑制作用，当清水对照处理的稻瘟病菌菌丝几乎长满平板时，嗜铁素粗提液5 和10 μL 处理的病原菌生长半径分别为17.4 和13.1 mm；当清水对照处理的水稻纹枯病菌菌丝几乎长满平板时，嗜铁素粗提液5 和10 μL 处理的病原菌生长半径分别为19.5 和15.1 mm。随着嗜铁素粗提液剂量的增加，抑菌作用明显增强。

图6 嗜铁素粗提液对稻瘟病菌和水稻纹枯病菌的室内抑菌能力检测Fig.6 Effect of siderophore produced by strain YL2021 on M.grisea and R.solani

清水和空白培养基对欧文氏菌、水稻白叶枯病菌均无抑制作用，不能形成抑菌圈（图7）。嗜铁素粗提液5 和10 μL 处理对两种供试细菌均具有较好的室内抑制作用，并且随着剂量的增加，抑菌圈直径增大。嗜铁素粗提液5 μL 处理对水稻白叶枯病菌和欧文氏菌的抑菌圈直径分别为26.1 和15.3 mm，嗜铁素粗提液10 μL 处理对水稻白叶枯病菌和欧文氏菌的抑菌圈直径分别为30.5 和34.3 mm（图8）。

图7 嗜铁素粗提液对水稻白叶枯病菌和欧文氏菌的室内抑菌能力检测Fig.7 Effect of siderophore produced by strain YL2021 on X.oryzae pv.oryzae and E.amylovora

3 讨论

自20 世纪六十年代起，随着生物防治相关研究的深入，生物农药在世界范围内被广泛研究应用[15]。发酵工艺优化是微生物产品化的重要环节，由于微生物培养发酵的影响因素复杂繁多，因此基于不同理论系统形成了多种试验方法，其中研究应用较多的有：单因素试验法、正交设计试验法、响应曲面法等[16]。目前，国内研究报道的嗜铁素发酵工艺优化大多通过单因素设计试验进行，如梁建根等[17]通过单因素试验优化恶臭假单胞菌PseudomondsputidaHZ-2 产嗜铁素的发酵条件，嗜铁素相对含量提高约10%；伊艳杰等[18]通过单因素试验优化荧光假单胞菌P.fluorescensRB5 产嗜铁素的发酵条件，优化后 RB5 发酵液中OD400值为2.35，嗜铁素产量较优化前提高了3 倍左右；余贤美等[19]通过单因素试验研究不同培养条件对枯草芽胞杆菌B.subtilisBS-15 嗜铁素产量的影响，结果表明：外源氨基酸的添加（如色氨酸）可以显著提高枯草芽胞杆菌BS-15 嗜铁素产量，发酵液OD510值可以达到0.387。本文在前人研究的基础上，除了在培养基中添加外源氨基酸外，采用响应曲面法优化贝莱斯芽胞杆菌YL2021 高产嗜铁素的发酵工艺，构建的回归模型具有较高的拟合性，菌株YL2021 发酵液OD510实测值与模型预测值在0.05 水平上无显著差异。优化后，菌株YL2021 发酵液OD510实测值为1.109，嗜铁素产量提高了10.34 倍，优化效果非常明显。

有研究表明，嗜铁素的合成大都受到转录因子-铁摄取调节蛋白Fur（ferric uptake regulator）的调控[20]，holo-Fur 负调控嗜铁素的合成，即当细菌体内铁离子充足时，Fur 蛋白通过感应胞内的Fe2+浓度，并与Fe2+结合形成holo-Fur 复合物，该复合物可以识别靶标基因启动子区的特殊序列（FUR box），阻止RNA 聚合酶与DNA 结合，从而抑制靶标基因的转录[21]。当细菌体内铁离子匮乏时，Fe2+从holo-Fur 复合物解离，靶标基因可以正常转录[22]。因此，可以运用生物信息学分析和遗传改良的方法，解除Fur 蛋白阻遏作用，以进一步提高菌株YL2021 中嗜铁素的产量。

近年来，生物农药具有可持续发展、保护农业生态环境、保障食品安全等优势发展较快[23]，其中应用广泛的有苏云金芽胞杆菌[24]、枯草芽胞杆菌[25]及木霉[26]等，但生物农药在全球农药市场份额占比仍然很低[27]，主要原因包括：产品货架期短、防治效果见效慢、应用技术要求高等[28]。其中，影响产品货架期的因素包括：产品自身特性、产品制剂类型、产品环境条件要求等[29]。前期工作结果表明，在缺铁条件下，贝莱斯芽胞杆菌YL2021 产生的嗜铁素是其重要的生防因子。本文研究结果进一步发现，菌株YL2021产生的嗜铁素对病原真菌和病原细菌的生长抑制作用随着嗜铁素剂量增加而增强。但是在田间应用时，嗜铁素对环境条件的要求（紫外光、温度等）、持效期及其对植株和土壤中土著微生物的影响等还有待深入研究。