两种果蝇对不同成熟期草莓果实及其挥发物的趋性行为分析

张 璇，毕亚銮，方 琦，汪 芳，叶恭银

（浙江大学农业与生物技术学院/水稻生物学国家重点实验室，杭州 310058）

黑腹果蝇Drosophilamelanogaster和斑翅果蝇D.suzuki皆属双翅目Diptera、果蝇科Drosophilidae、果蝇属Drosophila，是世界范围内重要的水果害虫[1,2]。它们能为害蔷薇科Rosaceae 的樱桃Prumuscerasus[3]、树莓Rubusidaeus[4]、栽培草莓Fragaria×ananassa[5]，杜鹃花科Ericaceae 的蓝莓Vacciniumcorymbosum[6]等多种浆果类水果。果蝇为害主要发生在山东[3]、云南[7]、贵州[8]、福建[6]和浙江[9]等地。斑翅果蝇能利用其尖锐的产卵器在健康的果实中产卵[10]，产卵造成的伤口会使果实更容易遭受其他果蝇的为害或微生物的侵染[11]。黑腹果蝇则偏好在破损和腐烂的果实中产卵[12]，果蝇幼虫孵化后会在果实内部钻蛀取食，继而导致果实产量和品质的下降[11,12]。在浙江临海，黑腹果蝇幼虫的蛀食导致杨梅果实凹凸不平、果汁外溢、落果，对杨梅的贮藏和商品价值都造成较大影响[13]。此外，果蝇能够传播葡萄酸腐病等植物病害[14]，在没有斑翅果蝇存在的情况下，黑腹果蝇通过产卵和幼虫取食导致葡萄酸腐病的发生；在两种果蝇共存的情况下，斑翅果蝇造成的伤口则能加剧黑腹果蝇在葡萄园中的繁殖与侵害，造成巨大的经济损失[15]。

目前，果蝇的防治主要依赖化学药剂。氯虫苯甲酰胺、啶虫脒、氯氟氰菊酯、氟啶脲和联苯菊酯等杀虫剂对果蝇都有较强的毒杀作用[16,17]。但大量化学农药的长期使用不仅会导致农药残留问题，也会增强果蝇的抗药性[18]，并给人畜环境和天敌昆虫带来不良影响[19]。绿色高效的监测和诱捕技术的研发是果蝇生物防治亟需解决的重要问题。常用的诱捕剂主要有苹果醋、糖醋液等[17,20]，然而在果实成熟期，寄主果实往往比苹果醋等引诱剂对果蝇具有更强的引诱力[21]。因此，从昆虫的寄主植物中寻找具有引诱效应的挥发物组分成为引诱剂研发的新方向。植物挥发物是植食性昆虫搜寻、定位寄主的重要线索[22]。例如，小菜蛾Plutellaxylostella成虫依靠十字花科Brassicaceae 挥发的异硫氰酸酯类化合物定位寄主植物[23]。类似地，果蝇也通过感知寄主的挥发物来觅食、寻找配偶和选择产卵地[24]。成熟杨梅果实挥发物对已交配和未交配的斑翅果蝇雌虫有显著的引诱效果，而半熟杨梅和生杨梅果实挥发物仅对未交配雌虫有引诱效果[25]；Urbaneji-Bernat 等[26]发现，相比栽培蓝莓，斑翅果蝇更倾向于选择野生蓝莓为寄主，这可能与野生蓝莓中的9 种挥发物有关。这些研究表明，寄主植物的挥发物对果蝇的行为有重要的影响。

栽培草莓是果蝇的主要寄主植物之一，相比树莓、黑莓、樱桃、蓝莓，草莓对斑翅果蝇具有更强的吸引效果[5]。挥发性酯类化合物是草莓果香的重要组成部分，栽培草莓释放的挥发性酯类化合物多于野生草莓F.vesca，不同品种栽培草莓间挥发物种类和含量也具有差异[27]。研究表明，斑翅果蝇对草莓挥发物组分乙酸异戊酯有显著的触角电位反应[5]；草莓、蓝莓和樱桃共有挥发物中的己醛、2-庚酮能增强乙酸和乙醇混合液对斑翅果蝇的引诱力[28]。但目前有关不同成熟阶段的草莓挥发物组成，以及草莓挥发物对果蝇的影响尚不清楚。为此，本研究在比较不同成熟期草莓对黑腹果蝇和斑翅果蝇的引诱力的基础上，利用顶空固相微萃取HS-SPME（Headspace solid-phase microextraction）结合气相质谱联用仪GC-MS（Gas chromatograph-mass spectrometer）收集分析了其挥发物组分的异同，筛选了一些挥发物组分并分析了两种果蝇对这些挥发物组分的行为反应，旨在为研发果蝇的高效诱捕剂筛选出具有应用潜力的化合物。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

本试验所用的野生型黑腹果蝇w1118系本实验室保存的品系；野生型斑翅果蝇由山东省农业科学院植物保护研究所于毅研究员惠赠。两种果蝇在实验室以人工饲料继代饲养，饲料配方参照倪旭阳[29]。培养条件为25 ℃，70%相对湿度和光周期12L:12D。

1.2 供试水果材料及成熟度分级

试验所用的草莓品种为红玉，采自浙江省建德市红群草莓采摘基地。草莓采摘带回后用去离子水洗净，储存在4 ℃冰箱中备用。本试验根据草莓颜色将其成熟度分为三类：一类为白熟期，特征为果实外观白色部分占比多于红色部分；二类为红熟期，特征是整个草莓果实外观全为红色；三类为腐坏期，特征是果实表面有病斑，果实质地软烂（图1）。

图1 草莓成熟度分级Fig.1 Strawberry maturity classification

1.3 供试化学品及配制方法

试验所用的化学品均购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，包括乙酸乙酯（CAS No.141-78-6，纯度99.9%）、己酸甲酯（CAS No.106-70-7，纯度99.7%）、芳樟醇（CAS No.78-70-6，纯度98.0%）、癸酸乙酯（CAS No.110-38-3，纯度99.0%）、肉桂酸乙酯（CAS No.103-36-6，纯度98.0%）、石蜡油（CAS No.8012-95-1）。试验时将待测化合物按照0.1%的体积比添加于石蜡油中，涡旋振荡混匀备用。0.1%的乙酸乙酯对两种果蝇有显著的吸引作用，将其按体积比稀释为0.05%、0.025%、0.01%、0.005%、0.0025%后分别进行试验。

1.4 果蝇对不同成熟期草莓果肉的趋性

使用自制的双选择陷阱装置测试果蝇对不同成熟期草莓的趋性。黑腹果蝇试验装置，由一个带盖的聚丙烯塑料保鲜罐（罐身直径115 mm×高170 mm，1600 mL）和两个聚丙烯塑料果蝇管（直径24 mm×高95 mm）组成[30]。在保鲜罐的两侧用电烙铁掏出两个孔径分别为60 mm 和20 mm 的洞口，孔径为60 mm的洞口覆盖上40 目的黄铜网用于空气流通，孔径为20 mm 的洞口用于释放果蝇。将1000 μL 移液管剪去尖端8 mm 后穿过海绵塞（24 mm×24 mm），塞在果蝇管上制成陷阱。将两个陷阱管置于保鲜罐中与两孔垂直的中心线上，距离中心点20 mm 处。斑翅果蝇的试验装置与黑腹果蝇试验装置基本相同。由于斑翅果蝇的活动力较黑腹果蝇弱，特将果蝇管用电烙铁截短至40 mm 高，将1000 μL 移液管替换为截去尖端10 mm 的200 μL 移液管。

将草莓去蒂放入破壁机匀浆，称取5 g 匀浆后的果肉用于试验。试验Ⅰ：测试陷阱管中放入5 g 草莓果肉匀浆，对照陷阱管中放入5 g 的1%琼脂凝胶，共设三组试验，即白熟草莓vs琼脂凝胶、红熟草莓vs琼脂凝胶、腐坏草莓vs琼脂凝胶。试验Ⅱ：两陷阱管内放入5 g 不同成熟期的草莓果肉匀浆，共设两组试验，即白熟草莓vs红熟草莓、红熟草莓vs腐坏草莓。选取羽化3～5 d 生长一致的果蝇雌成虫进行试验，试验前将果蝇保湿饥饿处理4 h。每组试验设置20 次重复，每重复30 头果蝇雌成虫，24 h 后统计两个果蝇管陷阱中果蝇数量。试验在25 ℃，70%相对湿度，光照均匀且无异味的封闭木箱中进行。

1.5 不同成熟度草莓的挥发物收集

挥发物的收集采用顶空固相微萃取（HS-SPME）技术。匀浆后的果肉放入50 mL 棕色顶空样品瓶（美国安捷伦公司）中，用封口膜和锡纸将瓶口密封后置于铁架台底座。将50/30 μm 二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）涂层的萃取头（美国色谱科公司）安装于萃取手柄，在气相色谱仪上270 ℃老化40 min 以除去萃取头上吸附的杂质，而后固定在铁架台上，高度以萃取头的最低处距样品最高处1 cm 为宜，萃取在25 ℃且无异味环境下进行，萃取时长为40 min。每组试验设置3 次重复。

1.6 GC-MS 分析

采用安捷伦气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析收集到的挥发物。首先将萃取头上收集到的挥发物进行解吸附，将萃取头插入气相色谱仪（安捷伦7980B）进样口250 ℃解吸3 min。解吸得到的混合挥发物气体以氦气为载气，按 1 mL/min 的流速进入（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷毛细管色谱柱（HP-5MS，30 m×250 μm×0.25 μm）对挥发物组分进行分离。挥发物进样采用不分流模式。升温程序如下：40 ℃保持1 min，以2 ℃/min 的速度上升至60 ℃，保持2 min，再以20 ℃/min 的速度上升至180 ℃，保持5 min。利用串联的质谱仪（安捷伦7000C）对挥发物组分进行分析。质谱分析条件如下：电子轰击（EI）离子源，电子能量70 eV，质量扫描范围为m/z 35～500。通过比对标准质谱图库（NIST17）鉴定挥发物的种类。

1.7 有效挥发性组分鉴定

黑腹果蝇试验装置如1.4 所述，果蝇陷阱管内加入5 g 1%琼脂凝胶作为其水分来源以保障其存活。称取0.15 g 棉花搓成棉球置于凝固后的琼脂凝胶上方，试验组棉球加入500 μL 的待测化合物标准品溶液，对照组加入等体积的石蜡油。将饥饿4 h 的黑腹果蝇雌成虫放入试验装置中，24 h 后统计陷阱管中黑腹果蝇的数量。

挥发性组分对斑翅果蝇的行为效应采用图2 所示试验装置进行分析。该装置由一个500 mL 长方体聚丙烯塑料盒（长172 mm×宽118 mm×高34 mm）和两根聚丙烯果蝇管（直径24 mm×高95 mm）组成。塑料盒底部距离中心点65 mm 处的左右两侧分别开一个直径25 mm 的圆孔；果蝇管用120 目纱布封口，纱布中央打有直径3 mm 的小孔，将封口的果蝇管插入塑料盒的圆孔内。试验时在果蝇管中加入10 g 含10%蔗糖的1%琼脂凝胶，用于保持斑翅果蝇的活力，防止其死亡。将500 μL 待测标准品溶液和对照石蜡油分别加入0.15 g 棉球中放入果蝇管内，用纱布封口时尽量确保3 mm 小孔位于果蝇管的正中央，并用封口膜固定纱布。将饥饿4 h 的斑翅果蝇雌虫放入试验装置中，24 h 后统计陷阱管中斑翅果蝇的数量。

图2 斑翅果蝇双陷阱选择试验装置（挥发物组分测定）Fig.2 Two-choice trap for D.suzukii ( for volatile compound tests)

试验在25 ℃，70%相对湿度的无异味环境中进行。设20 次重复，每重复30 头虫。

1.8 数据统计与分析

试验数据采用DPS 软件[31]进行统计分析，采用配对两处理t检验分析试验组和对照组陷阱中果蝇数量的差异显著性，P＜0.05、P＜0.01 分别表示差异显著和极显著。

2 结果与分析

2.1 果蝇对不同成熟期草莓果肉的趋性

为了排除果实形状与颜色对果蝇行为试验的干扰，本试验中草莓果肉都进行了匀浆处理。双选择陷阱试验结果表明，各成熟阶段的草莓果肉对黑腹果蝇雌成虫有极显著的吸引效果（P＜0.001）。选择白熟期、红熟期和腐坏期的草莓果肉的雌成虫数量分别是选择琼脂凝胶的13.30，4.56，33.53 倍。雌成虫在白熟期和红熟期的草莓之间无明显的偏好（P＝0.9930），而趋向于腐坏的草莓果肉的雌成虫数量是趋向红熟期草莓的11.80 倍，腐坏期草莓果肉对雌成虫吸引力显著高于红熟期草莓（P＜0.001）（图3A）。

图3 果蝇雌成虫对不同成熟期草莓的趋性行为分析Fig.3 Tropism behavior analysis of female flies to strawberries at different mature stages

同样，各成熟阶段的草莓果肉对斑翅果蝇雌成虫也有极显著的吸引效果（P＜0.001）。白熟期、红熟期和腐坏期的草莓果肉陷阱中雌成虫数量分别是琼脂凝胶陷阱的5.35，11.46 和14.42 倍；雌成虫在白熟期和红熟期的草莓之间无明显的偏好（P＝0.9859），然而腐坏期草莓对雌成虫吸引力显著高于红熟期草莓（P＜0.001），腐坏期草莓陷阱中雌成虫的数量比红熟期草莓陷阱中高4.67 倍（图3B）。

2.2 不同成熟度草莓挥发物的分析

首先，对20 g、5 g 和1 g 三个不同质量的红熟期草莓样品挥发物进行了分析。GC-MS 结果表明，20 g草莓果肉匀浆萃取40 min 后，获得的挥发物共11 种，各组分的峰面积在1.28×107～108.51×107；5 g 草莓样品测得的挥发物共有16 种，各组分的峰面积在0.35×107～110.73×107；1 g 草莓样品测得的挥发物共有9 种，各组分的峰面积在0.65×107～35.33×107（表1）。挥发物组分面积与草莓果肉质量不呈线性关系，1 g 草莓样品中测得的挥发物种类少、组分面积低；5 g 草莓样品中测得的挥发物种类最多，20 g 草莓果肉样品中测得的挥发物种类反而少于5 g，且仅个别组分的峰面积显著高于5 g 样品中组分的峰面积。因此，采用5 g 草莓样品进行不同成熟期草莓挥发物组分的收集和分析。

表1 不同质量红熟期草莓挥发物组分分析Table 1 Analysis of volatiles from strawberries at red-ripe stage with different quality

考虑到两种果蝇对白熟期和红熟期的草莓没有显著的偏好，因此仅选取了红熟期和腐坏期两个成熟阶段的草莓进行挥发物的收集分析。在红熟和腐坏两个时期的红玉草莓中共收集到21种挥发性化合物（表2），包括18 种酯类物质、2 种醛类物质和1 种醇类物质。仅有己酸乙酯和乙酸己酯在两个成熟阶段的草莓中都被检测到。乙酸甲酯、丁酸甲酯、己醛、2-己烯醛、己酸甲酯、（Z）-己-2-烯基乙酸酯、己酸-1-甲乙酯、芳樟醇、辛酸甲酯、丁酸己酯和己酸己酯11 种挥发物组分仅在红熟期草莓中检测到；其中，己醛、2-己烯醛和己酸甲酯3 种化合物的相对含量最高（16.27%～24.01%）；而乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、惕各酸乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和肉桂酸乙酯8 种化合物仅在腐坏期草莓中检测到，其中，乙酸乙酯的相对含量最高（45.72%），其次为乙酸异戊酯（20.17%）。

2.3 果蝇对挥发物组分的行为反应

根据红熟期和腐坏期草莓挥发物分析结果，我们筛选了在腐坏期草莓中相对含量最高的乙酸乙酯、在红熟期草莓中相对含量较高的己酸甲酯，以及能够买到标准样品的一些差异化合物组分包括癸酸乙酯、肉桂酸乙酯和芳樟醇进行了果蝇的行为反应测定。两种果蝇对5 种草莓挥发物组分的行为反应一致（图4，图5）。仅有乙酸乙酯对两种果蝇具有显著的吸引作用，0.005%～0.05%的乙酸乙酯均能显著吸引两种果蝇，对黑腹果蝇雌成虫吸引效果更好（图4A，图5A）。两种果蝇对0.1%的癸酸乙酯、肉桂酸乙酯、己酸甲酯和芳樟醇4 种化合物无行为反应（图4B，图5B）。

图5 斑翅果蝇雌成虫对5 种草莓挥发物标准品的行为反应Fig.5 Behavioral responses of D.suzukii female adults to 5 volatile components from strawberries

3 讨论

昆虫的嗅觉系统非常灵敏，能感知植物挥发性气味的细微变化从而选择更合适的寄主。刘燕等[25]利用Y-型嗅觉仪进行试验，结果表明相较于生杨梅和半熟杨梅，成熟杨梅果实对斑翅果蝇具有更强的引诱力。本研究参考Karageorgi 等[32]的试验装置比较了黑腹果蝇和斑翅果蝇对不同成熟期草莓果肉的行为反应。但斑翅果蝇在进行试验的24 h 内，死亡率达30%～70%。推测可能是由于斑翅果蝇的活动性和生命力不如黑腹果蝇。因此对陷阱管的高度进行了调整，将果蝇管截断至40 mm，斑翅果蝇在试验中的死亡率下降。然而在用该装置进行挥发物标准品试验时，斑翅果蝇的存活率为20%～50%。因此，更换了新的试验装置进行试验（图2），并在琼脂凝胶中加入10%的蔗糖，该装置的优点在于陷阱口在其活动区域下方，降低了斑翅果蝇做出选择行为的难度。试验结果表明与琼脂凝胶对照相比，无论哪个成熟阶段的草莓果肉对两种果蝇都有显著的吸引效果。白熟期和红熟期的草莓对两种果蝇的吸引效果没有显著差异，而腐坏期的草莓对两种果蝇的吸引力显著高于红熟期草莓。Karageorgi 等[32]研究也表明黑腹果蝇和斑翅果蝇的雌虫偏好取食腐烂草莓，与本试验研究结果一致。这可能是由于果实腐坏期产生了大量的酵母，其挥发物增强了果实对果蝇的吸引力[33]。挥发物分析结果表明，红熟期和腐坏期的草莓挥发物组成差异较大，仅有乙酸己酯和己酸乙酯两个组分在两个成熟阶段都有检测到。红熟期的草莓挥发物中2-己烯醛、己酸甲酯、己醛和乙酸己酯的相对含量较高；腐烂期草莓挥发物中的乙酸乙酯和乙酸异戊酯的相对含量较高，分别为45.72%和20.17%。

寄主挥发物组分是高效特异性引诱剂研发的重要线索，已有一些具有吸引效应的挥发物组分从果蝇寄主中鉴定，如乙酸、己酸、水杨酸甲酯等能吸引果蝇取食或产卵[5]，乙酸异戊酯能引起斑翅果蝇的触角电位反应[5]。本研究选取了5 种草莓挥发物组分进行了果蝇行为反应的测试，仅有乙酸乙酯对两种果蝇有吸引效果。Padilla-Jiménez 等[34]研究表明芳樟醇等化合物在草莓成熟过程中的动态变化存在很大的品种间差异，本研究中只在红熟期草莓挥发物中检测到少量芳樟醇，两种果蝇对0.1%的芳樟醇无行为反应。Keesey等[35]研究发现黑腹果蝇的ab3A 嗅觉神经元对0.1%己酸甲酯有显著反应，然而在本试验中，两种果蝇对0.1%的己酸甲酯没有行为反应。癸酸乙酯和肉桂酸乙酯仅在腐坏期草莓中检测到且组分面积较低，两种果蝇对这两种低组分面积挥发物组分在0.1%浓度下均无行为反应。这些结果表明化合物的吸引效应与其浓度密切相关，需要设置更多不同的浓度才能进一步确定这些化合物是否对果蝇具有引诱效应。

酯类化合物是成熟水果挥发物的重要组分[27]，也是与草莓果实成熟过程中果香变化密切相关的一类物质[36]。本研究在2 个成熟阶段的草莓中共检测到了18 种酯类物质。其中，红熟期草莓中酯类化合物10 种，占所有挥发物组分总面积的59.72%；腐坏期草莓挥发物均为酯类化合物，其中乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯4 种组分的峰面积之和占所有组分总面积的89.94%。Padilla-Jimenez 等[34]研究也表明丁酸甲酯、丁酸乙酯、己酸甲酯等酯类化合物在草莓成熟后期的相对含量较高。酯类化合物对果蝇以及实蝇科的昆虫具有引诱效果。蓝莓挥发物中的乙酸异丁酯、乙酸异戊酯和丁酸乙酯等5 种酯类化合物对斑翅果蝇有显著吸引效果[26]；啤酒废酵母酶解液挥发物中的3 种酯类物质，乙酸辛酯、乙酸苯乙酯和辛酸乙酯对橘小实蝇成虫有良好的吸引效果[37]。本研究结果显示0.005%～0.05%的乙酸乙酯对黑腹果蝇和斑翅果蝇均有显著的吸引效果，但当浓度降低至0.0025%时，两种果蝇对乙酸乙酯没有行为趋性反应。Cha 等[38]研究发现在乙酸乙醇混合液中添加2%乙酸乙酯对斑翅果蝇的引诱效果显著下降。这表明果蝇对化合物的行为反应与环境中其他化合物组分的协同效应等相关，这可能也是其对不同成熟期果实有偏好差异的原因。乙酸乙酯吸引或趋避果蝇的浓度边界还有待进一步研究。同时，这一有效吸引果蝇的化合物组分需要田间试验以进一步明确其在果蝇防治中的应用价值。