文山引种阳春砂与其伪品巴双砂的鉴别

莫伟，班梦梦，张丹雁，范紫颖，杨丽

（1.广州采芝林药业有限公司，广东 广州 510360；2.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006；3.广东黄埔卫生职业技术学校，广东 广州 510700）

阳春砂来源于姜科植物阳春砂Amomum villosumLour.的干燥成熟果实，为四大南药之一，具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎等功效[1]。阳春砂以广东阳春为道地产区，引种于云南、广西等地，老挝、越南、缅甸亦有引种。

目前，市售阳春砂以云南文山、云南版纳、老挝和越南引种为主流商品[2]，随着进口阳春砂不断流入国内市场，本课题组调研发现在老挝引种阳春砂中两种均被云南当地药农称为“嫁接品种”的老挝巴双砂和老挝巴色砂，2种均为姜科豆蔻属植物，种源不明，因分别产自老挝巴双、巴色地区而得名，为新一轮两个常见阳春砂高仿伪品，被单独冒充或分别掺入文山引种阳春砂和版纳引种阳春砂中出售，其外观性状分别与两个云南阳春砂商品相似，非专业人士难以辨别[3]。前期本课题组报道了版纳阳春砂与巴色砂的性状、挥发油成分等特征鉴别[4]，但文山引种阳春砂与老挝巴双砂（以下简称巴双砂）未见报道，为准确有效地鉴别和区分阳春砂正伪品，规范阳春砂在市场的流通，本文采用传统经验鉴别、显微鉴别及理化鉴别法对云南文山阳春砂与巴双砂的性状、横切面及粉末显微、挥发油成分特征进行对比分析和鉴定，以期为阳春砂真伪鉴别提供科学参考依据。

1 材料、仪器及试剂

1.1 材料

文山阳春砂样品收集于云南省文山州马关县马白镇南山幸福社区引种的阳春砂，巴双砂样品收集于老挝产区，又称“老挝巴双砂”。经广州中医药大学张丹雁教授鉴定阳春砂为姜科豆蔻属植物阳春砂（Amomum villosumLour.）的干燥成熟果实，巴双砂为阳春砂同属伪品，种源不明。样品保存于广州中医药大学中药鉴定实验室。

1.2 仪器

SX70HS 长焦照相机（佳能）；DFT-150 粉碎机（温州顶历医疗器械有限公司）；B302 生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）；STP120 组织脱水机、HistoStar组织包埋机[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；JB-L5 冻台（武汉俊杰电子有限公司）；HM 340E 轮转式切片机[赛默飞世尔（上海）仪器有限公司]；DS-1500A 电子天平（佛山市顺德区拓普域电子有限公司）；FA1004N 万分之一分析天平（上海菁海仪器有限公司）；TC-15 恒温电热套（海宁市华星仪器厂）；Agilent7693自动进样器、7890B气相色谱仪、Agilent5977质谱仪（美国安捷伦公司）。

1.3 试剂

50%FAA 固定液（批号20210206，福州飞净生物科技有限公司）；无水乙醇（批号20210720，天津市致远化学试剂有限公司）；二甲苯（批号20200620，天津市致远化学试剂有限公司）；水合氯醛（批号20190301，天津市大茂化学试剂厂）；丙三醇（批号20190708，天津市广成化学试剂有限公司）；以上试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 性状鉴定法

通过传统性状鉴别方法对文山阳春砂和巴双砂外观形状、颜色、表面毛刺、种子团、种子形状、气味等特征进行对比鉴别。

2.2 显微鉴定法

2.2.1 横切面显微[5]采用常规石蜡切片法制备文山阳春砂和巴双砂种子横切面显微装片，镜检，拍摄显微特征。

2.2.2 粉末显微 文山阳春砂和巴双砂种子粉碎后过五号筛，制片并置于显微镜下观察，拍摄显微特征。

2.3 挥发性成分分析

2.3.1 挥发油提取 取样品粉末约15 g，精密称定后置于500 mL圆底烧瓶中，加入300 mL蒸馏水，参照《中国药典》2020 年版四部通则“2204”中挥发油提取测定法（甲法）提取，加热保持微沸约4 h，至挥发油量不再增加时停止加热，静置冷却至室温，读取挥发油含量，计算挥发油提取率。

2.3.2 供试品的制备 精密吸取“2.3.1”项所得挥发油20 μL，石油醚定容至2 mL，混合均匀后过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3.3 GC-MS 条件 色谱条件：HP-5ms UI 型毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；程序升温：初始温度50 ℃，然后以5 ℃/min升至230 ℃，保持14 min。载气：高纯度氦气；流速：1 mL/min；分流比100∶1；进样量：1 μL。

质谱条件：离子源230 ℃，接口280 ℃；扫描范围：m/z50～550；溶剂延迟3 min。

2.3.4 样品测定及数据处理 取供试品溶液进样分析，通过与NIST14 质谱数据库进行对照，计算机自动检索并进行文献比对，对各色谱峰进行鉴定，采用色谱峰面积归一化法计算样品挥发油中各成分的相对质量分数。

3 结果

3.1 性状鉴别

文山阳春砂类圆球或卵圆形，浅黄棕色、棕色或紫棕色；表面毛刺粗短且稀疏，刺基宽扁而粗，具不明显钝三棱，果实顶端钝，花被基凸起明显；果皮稍厚，鼓起，内表面浅棕、浅黄棕或黄白色；种子团三瓣，隔膜外延，种子多面体状长形，20～54粒；种子气芳香，味微苦涩、微辛凉，成熟度高者味甜，辛凉感弱。

巴双砂卵形，棕褐或黑褐色；表面毛刺稀疏，细纵棱多而明显，果实顶端尖，有时略歪斜，花被基短且微突；果皮稍厚，略贴种子团，内表面浅黄棕或棕色；种子团三瓣，隔膜外延，种子多面体状三角形，40～75 粒；果壳稍具烟熏气，种子味苦涩，香气特异似山姜果。见图1。

图1 文山阳春砂（A）和巴双砂（B）的外观性状特征Figure 1 Character identification of A. villosum Lour. from Wenshan(A)and Bashuang sha(B)

3.2 显微鉴别

3.2.1 横切面显微特征 文山阳春砂种子横切面：假种皮薄壁细胞皱缩呈条形，或膨胀呈类圆形，常含方晶；种皮表皮细胞1列，斜径向类方形，壁略厚，胞腔斜类方形；下皮细胞1 列，内含黄棕色色素，偶见向种皮表皮细胞层乳状凸起，凸起处种皮细胞小而不规则；油细胞1 列，横向或径向，长方形或类方形，长短不一，长至78 μm；色素层3～5列细胞，大小长短不一，不规则状，浅黄棕色；内种皮细胞1列，红棕色，中间内凹略成杯状，内壁极厚，外壁薄，胞腔极小，内含细小硅质块；外胚乳细胞大，径向延长的长条形，内含淀粉粒、草酸钙方晶等；内胚乳细胞小，多角形，内含糊粉粒。

巴双砂种子横切面：假种皮薄壁细胞皱缩呈条形，或膨胀呈类圆形，含方晶；种皮表皮细胞1列，斜径向扭曲，侧壁及内壁均匀增厚，外壁极厚，达49 μm，层纹不明显，胞腔小或不明显，扭曲；下皮细胞1～2 列，极扁小，内含黄棕色色素，偶见向种皮表皮细胞层乳状凸起，凸起处种皮细胞小而不规则；油细胞1 列，横向长方形或类方形，长至118 μm；色素层4～5 列细胞，不规则瘦长椭圆形，浅黄棕色；内种皮细胞1 列，黄棕至红棕色，中间内凹略成杯状，内壁极厚，外壁薄，胞腔极小，内含细小硅质块；外胚乳细胞大，径向延长的长条形，内含淀粉粒、草酸钙方晶等；内胚乳细胞小，多角形，内含糊粉粒。见图2。

图2 文山阳春砂（A）和巴双砂（B）种子的横切面显微特征Figure 2 Micrographs of seeds of A. villosum Lour. from Wenshan(A)and Bashuang sha(B)

3.2.2 粉末显微特征 文山阳春砂粉末：假种皮无色或淡黄色，成团散在，壁极薄，常皱缩呈不规则形状，内含方晶；种皮表皮细胞淡黄色，表面观长条形，末端渐尖或钝圆，常断裂，断面观方形、类方形或多边形，常与下皮细胞上下层垂直排列；下皮细胞黄棕色或红棕色，表面观呈类长方形或类长圆形略规则排列，断面观不规则细长条形；油细胞无色或淡黄色，表面观呈类方形或类圆形，断面观类长方形，多破碎，有的胞腔内可见油滴；色素块红棕色或深棕色，常破碎成不规则状；内种皮细胞黄棕色或棕色，边缘不规则破碎，成片，表面观呈多角形，壁厚，内含硅质块，断面观少见，1 列，栅状排列；外胚乳细胞呈类长方形，内含大量细小淀粉粒聚集形成的淀粉团，有的淀粉团中可见细小散在的方晶；草酸钙方晶存在于假种皮、外胚乳中。

巴双砂粉末显微特征与阳春砂粉末相似，难以准确区别。见图3。

图3 文山阳春砂（A）和巴双砂（B）的种子粉末显微特征Figure 3 Microscopic characteristics of seed powder of A.villosum Lour.from Wenshan(A)and Bashuang sha(B)

3.3 挥发性成分分析

二者挥发性成分总离子流图见图4、图5，主要成分见表1。可见二者主要含烯类、酯类、醇类等成分，主成分均为左旋乙酸冰片酯、左旋樟脑、右旋萜二烯、莰烯、（1S，2E，6E，10R）-3，7，11，11-四甲基双环[8.1.0]十一碳-2，6-二烯、合成右旋龙脑等。其中τ-Muurolol（0.60%）、（-）-1，7-二甲基-7-（4-甲基-3-戊烯基）-三环[2.2.1.0（2，6）]庚烷（0.58%）等为文山阳春砂特有成分；Neointermedeol（5.26%）、[S-（R*，S*）]-3-（1，5-二甲基-4-己烯基）-6-亚甲基-环己烯（0.76%）、g-硒烯（0.72%）等为巴双砂特有成分；此外，文山阳春砂左旋乙酸冰片酯含量明显比巴双砂高，左旋樟脑含量略低，而巴双砂中1-石竹烯明显比文山阳春砂高，可据此鉴别。

表1 文山阳春砂与巴双砂挥发油的化学成分及相对质量分数Table 1 Volatile components and relative contents of A.villosum Lour.from Wenshan and Bashuang sha

图4 文山阳春砂总离子流图Figure 4 TIC of A.villosum Lour.from Wenshan

图5 巴双砂总离子流图Figure 5 TIC of Bashuang sha

4 讨论

实验结果表明，文山阳春砂在果实形状、颜色、表面纹理及气味等性状特征与巴双砂存在差异；显微特征中，两者横切面种皮表皮细胞形状和细胞壁差异最明显，其次是种皮下皮细胞及色素细胞的列数等，两者粉末显微特征不明显，故阳春砂正伪品显微鉴定中横切面特征鉴别更有意义；挥发油化学成分对比表明，两者虽均含有乙酸冰片酯、左旋樟脑、右旋萜二烯、莰烯等共有成分，但文山阳春砂有效成分乙酸冰片酯含量明显高于巴双砂，且两者各自均含特有成分。据此可有效鉴别文山阳春砂正伪品。

以上差异除与加工方式、生态环境不同有关外，还与两者种源不同更为密切相关。云南地区过往多采用全程晒干方式加工阳春砂，果实色泽浅且质地疏松不紧实，容易散团散气变质，不易运输与保存，质差。近10 年来，云南砂仁种植户在政府和专家大力推广阳春砂科学种植和加工技术指导下，采取延迟采收的方法提高砂仁成熟度。加工技术方面，云南文山州多采用自动化或半自动化电烘箱烘烤技术，有时全程电烘烤至干燥，有时电烘烤中间过程增加了堆闷发汗步骤再继续烘干的操作，全程电烘烤者砂仁表面浅黄棕、黄棕色或紫红色，电烘烤中途发汗者表面颜色加深，黄褐色、紫棕色或棕褐色，电烘烤加发汗的砂仁果壳更加紧实不易爆裂，种子紧缩不易散团，更利于运输和存放，果实多数圆球形，有效成分转化、香气更加醇香，砂仁质量提高，市场占有度逐年上升[2]。相比之下，老挝阳春砂及其伪品巴色砂和巴双砂均采用柴火烘烤方法进行干燥加工处理，故果实表面色泽深，常呈棕褐或黑褐色，同时果壳稍具烟熏气。

本文对文山阳春砂与其常见伪品巴双砂从性状、横切面及粉末显微、挥发油成分等进行对比分析鉴别，结果显示二者在药材性状、横切面显微、挥发油成分均存在差异，特别是巴双砂果壳表面毛绒稀少，纵棱清晰而多，口尝香气特异似山姜果，两者挥发油虽然绝大多数成分相似，但各自均具独有成分，据此可有效鉴别文山阳春砂及老挝巴双砂。本研究为文山阳春砂真伪鉴别提供科学数据，对阳春砂进一步正本清源、提高质量、确保临床安全用药具有重要意义。