外泌体在肺癌免疫治疗中的作用*

曾娟，马士淇，张璐，张雨阳，朱桂全 ，曹邦荣

610041 成都，四川省肿瘤临床医学研究中心，四川省肿瘤医院·研究所，四川省癌症防治中心，电子科技大学附属肿瘤医院 放射肿瘤学四川省重点实验室（曾娟、马士淇、张璐、张雨阳、曹邦荣）；

610041 成都， 四川大学华西口腔医院，国家口腔疾病临床医学研究中心，口腔疾病研究国家重点实验室 头颈肿瘤科（朱桂全）

根据2020 年全球癌症统计数据，肺癌已成为第2 大常见癌症，但仍然是癌症死亡的主要原因，估计每年有180 万人（18%）死于肺癌［1］。近年来，除了传统的放疗和化疗外，出现了靶向治疗及免疫治疗等多种新的治疗方法。靶向程序性死亡受体1（programmed death 1，PD-1）/程序性死亡配体1（programmed death ligand 1，PD-L1）的免疫检查点抑制剂已被批准用于晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）患者的治疗，与传统化疗相比，这不仅显著提高了总生存期，而且减少了治疗相关的不良事件［2］。然而，通常只有20%～30%的患者有效，仍有大部分患者对其产生治疗抵抗［3］。此外，缺乏预测性生物标志物也限制了免疫检查点抑制剂的进一步临床应用［4］。因此，寻找其他免疫治疗方式迫在眉睫。

外泌体是由多种细胞分泌的脂质双层膜磷脂囊泡［5］。最初，外泌体被认为只参与细胞代谢废物管理，但随着研究的深入，研究人员发现外泌体在免疫应答、细胞增殖、炎症、代谢和神经功能中发挥着重要作用［6］。值得注意的是，肿瘤来源的外泌体（tumor-derived exosome， TDX）通过与肿瘤微环境（tumor microenvironment， TME）中的多种免疫细胞相互作用而诱导免疫逃逸，是肺癌免疫治疗失败的原因之一［7-9］。目前，靶向外泌体的肿瘤免疫治疗策略已引起研究者的关注，并取得了一定的进展，有望为肺癌患者的治疗提供新的思路，本文就外泌体在肺癌免疫治疗中的研究进展进行综述。

1 外泌体与TDX

多种细胞可释放不同类型的细胞外囊泡，根据其大小、生物发生和分泌方式分为3 类：微泡、凋亡小体和外泌体［10］。其中外泌体是一种纳米囊泡，直径为30～150 nm［11］，浮力密度为1.13～1.19 g/mL［12］。外泌体起源于细胞内体，发生过程包含3 个阶段。首先，质膜内凹形成早期内体。然后，内体膜向内出芽形成多个腔内小泡，转变为含有众多小囊泡的多泡体（multivesicular bodies， MVBs）。最后MVBs 将有两种宿命，与胞质内溶酶体融合导致MVBs 降解；或者与质膜融合，将MVBs 内的囊泡释放到细胞外间隙，形成外泌体［13-14］。外泌体形成主要依赖转运所需的内体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）途径［15］。然而，有研究表明当4 种ESCRT 复合物的关键亚基被耗尽时，仍可形成MVBs，提示存在不依赖ESCRT 的外泌体形成途径［16］。据报道，神经酰胺可以诱导外泌体的生物发生，促进神经酰胺合成的中性鞘磷脂酶2 能够调节外泌体形成［17］。此外，Rab 家族成员Rab5、Rab7、Rab27a、Rab27b 和Rab35 在外泌体的生物发生、运输和分泌中发挥着重要作用［18］。另外，外泌体的生物发生和分泌受外部刺激的影响，如热休克、氧化应激、化疗、辐照、缺氧和低温［19］。

外泌体携带了多种质膜和胞质相关分子，如蛋白质、核酸及脂质。在释放到细胞外环境后，外泌体可能通过3 种机制与受体细胞相互作用。一是配体-受体相互作用，即外泌体表面分子与靶细胞质膜上的分子相互作用；二是内吞，外泌体可通过网格蛋白依赖和网格蛋白不依赖的内吞作用被受体细胞吸收，如胞饮作用、大胞饮作用和吞噬作用；三是直接膜融合，外泌体直接与质膜融合，将其内容物释放到受体细胞质中［20］。因此，外泌体成为了细胞间信息交流的重要媒介。

TME 由癌细胞、成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞、细胞外基质和基质组织共同组成，是癌细胞赖以生存的复杂环境［21］。TME 中TDXs，通过诱导血管生成［22］、上皮-间质转化［23］及耐药性［22］，在肿瘤的发生、侵袭和转移中发挥着重要作用。值得注意的是， TDXs 通过影响TME 中的多种免疫细胞的免疫功能发挥肿瘤免疫调节作用，主要诱导免疫逃逸效应，在肺癌免疫治疗失败中发挥关键作用［23］。

2 TDX 与肿瘤免疫微环境

2.1 TDX 调控T 淋巴细胞分化及功能

研究发现，TDXs 可通过抑制效应T 细胞功能从而发挥肿瘤免疫逃逸作用。一方面，TDXs 可通过多种机制直接作用于T 细胞，抑制其增殖及功能。来自肺癌的外泌体可携带PD-L1，与T 细胞PD-1 结合后，可抑制T 细胞活化和促炎细胞因子的释放［24］。另外，Wang 等［25］发现肺腺癌来源的外泌体circRNA-002178 通过增强CD8+T 细胞PD-1 的表达，诱发T 细胞衰竭。TDXs 可影响TCR-CD3 复合物的相互作用，从而抑制CD4+和CD8+T 细胞激活［26］。TDXs 释放ULBP 和MICA，与细胞毒性T 细胞上NKG2D 结合，阻断了后者的肿瘤裂解作用［27］。TDXs 可通过线粒体通路及死亡受体通路诱导T细胞凋亡［28］。此外，TDXs 通过靶向有丝分裂原活化蛋白激酶1 （mitogen-activated protein kinase1，MAPK1）及Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/STAT 途径抑制T 细胞的增殖［29］。另一方面，TDXs 可通过调节调节性T 细胞（regulatory cells，Tregs）诱导肿瘤免疫逃逸。Huang 等［30］发现肺癌细胞外泌体的表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）可诱导幼稚的CD4+T 细胞分化为Tregs。TDXs 通过TGF-β和 IL-10 依赖机制增强Tregs 增殖［23］。此外，TDXs 携带细胞因子CCL20 可招募Tregs，发挥免疫抑制作用［31］。同时，TDXs 可调节Tregs 表面CD39 和CD73 的表达及腺苷产生，后者与T 细胞受体A1，A2A，A2B 和A3 结合可抑制T 细胞功能［23］。

2.2 TDX 抑制NK 细胞的肿瘤杀伤作用

NKG2D 是NK 细胞表面的一种刺激性受体，当其与表达于肿瘤细胞表面的NKG2D配体（NKG2DL）结合后，可被激活而发生脱颗粒作用，介导肿瘤细胞死亡。而TDXs 可携带可溶性NKG2DL（sNKG2DL）如MICA 及MICB，导致肿瘤细胞逃避NK 细胞的毒性作用［32］。Berchem 等［33］发现肺癌细胞系来源的外泌体通过传递转化生长因子β1，降低NKG2D 表达，从而抑制NK 细胞的细胞毒功能。TDXs 也可能通过其他机制减弱NK 细胞活性。TDXs HSP70 与表达TLR2 的MDCSs 相互作用诱导免疫抑制因子的产生，从而损害NK 细胞的活性［34］。外泌体miR-92b 可抑制NK 细胞表达CD69 及损害NK 细胞的细胞毒性作用［35］。 肿瘤外泌体circUHRF1 可抑制NK 细胞分泌IFN-γ和TNF-α及其细胞毒功能，同时还与TME 中NK 细胞数量下降有关［36］。Wan 等［37］发现来自晚期恶性胸膜间皮瘤患者的TDXs 能抑制IL-2 诱导的NK 细胞增殖。另外在小鼠模型中，TDXs 降低了肺内NK 细胞的百分比［23］。

2.3 TDX 促进巨噬细胞向M2 型极化

作为免疫系统的关键成分之一，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage， TAMs）在肿瘤免疫调节中发挥着重要作用。TAMs 可极化为抗肿瘤M1 表型或促肿瘤M2 表型［32］。TDXs 可通过多种机制促进M2 型极化。多种外泌体RNA 可促进TAMs 向M2 型极化。肿瘤外泌体miR146a 通过SALL4-miR146a 轴促进了M2 的极化［32］。来自p53突变的癌细胞外泌体miR-1246 可以诱导巨噬细胞极化为促肿瘤M2 表型［38］。M1 型主要通过糖酵解获得能量，而M2 型更依赖有氧代谢，肺TDX 通过改变巨噬细胞能量代谢途经诱导巨噬细胞向M2 表型极化［39］。细胞骨架蛋白重排是巨噬细胞活化及成熟的原始特征［40］。肿瘤干细胞来源的外泌体可通过改变单核细胞的形态和肌动蛋白骨架，促进单核细胞向M2 表型分化［41］。有趣的是，低氧条件可增强外泌体诱导巨噬细胞向M2 型极化的作用。Hsu 等［42］发现低氧肺癌细胞的外泌体miR-301a 通过下调巨噬细胞极化蛋白PTEN 表达诱导M2 表型。

2.4 TDX 与树突状细胞及髓源性抑制细胞（myeloid derived suppressor cells，MDSCs）

树突状细胞（dendritic cell，DC）是来源于骨髓干细胞的特异性抗原呈递细胞，通过处理抗原并将其呈递给T 细胞，在免疫反应中发挥着重要的功能［29］。多项研究发现TDXs 可抑制DCs 的抗原呈递功能。TDXs miR-212-3p 通过抑制DCs 表达MHC-II 发挥免疫耐受功能［43］。Huang 等［30］发现超过80%来源于肺癌的外泌体携带EGFR，传递给DCs 后诱导其分化成耐受性DCs，从而促进CD4+T细胞分化成Tregs。

MDSCs 是一种异质的不成熟骨髓细胞，可介导免疫抑制性TME［44］。TDXs 可加强MDSCs 的免疫抑制作用并调节其丰度。Alipoor 等［23］证明了TDXs 表面的HSP72，以TLR2/ MyD88 依赖的方式激活STAT3，增强了MDSCs 对T 细胞的抑制作用。此外，体外培养的B16 肿瘤细胞释放的外泌体能够以TLR2 依赖的方式诱导MDSCs 增殖［44］。同时，Ren 等［45］报道TDXs 通过传递miRNA-107 可促进MDSCs 增殖。

3 外泌体在肿瘤免疫治疗中可作为潜在的生物标志物

肿瘤免疫治疗旨在增强人体固有防御以消除肿瘤细胞，它的出现使肿瘤治疗发生了革命性改变。肿瘤免疫治疗主要包括溶瘤病毒治疗、肿瘤疫苗、细胞因子、过继细胞移植治疗和免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors， ICIs）。而目前NSCLC的免疫治疗主要指以PD-1/PD-L1 抗体为免疫检查点抑制剂的代表性药物［46］。以下提到的免疫治疗特指PD-1/PD-L1 抑制剂。

近年来，PD-L1 表达、肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤突变负荷、某些驱动基因突变和微卫星不稳定性/缺陷错配修复等生物标志物，被提出用于预测免疫治疗的疗效和预后［47］，但它们都不能很好地用于对免疫治疗有反应的NSCLC 患者。例如，一些研究揭示了PD-L1 表达与PD-1/PD-L1 靶向剂的潜在效益之间呈正相关［48］。在另一项随机研究中，PD-L1 表达水平不能预测生存获益［49］。总之，PD-L1 的表达并不总是与免疫治疗的潜在好处一致，这可能源于肿瘤的时空异质性［50］。外泌体PD-L1 可以动态显示PD-L1 的平均表达水平，可能作为免疫治疗的潜在生物标志物［51］。Yang 等［52］发现，在ICIs 治疗2个月时外泌体PD-L1 的变化高于基线时的NSCLC患者有更好的无进展生存期和总生存期。然而，Del 等［53］研究表明，血浆来源的外泌体PD-L1 在治疗有效的NSCLC 患者中显著下调，而在疾病进展的受试者中则升高，这也被另一项研究证实［54］。此外，Shimada 等［55］发现基线外泌体PD-L1 可以很好地区分应答者和非应答者。外泌体PD-L1 的预测价值有待进一步研究。此外，hsa-miR-320 家族的3个miRNA 被鉴定为潜在的生物标志物，以选择患者接受晚期NSCLC 的免疫治疗，其中外泌体miRNA miR-320d 被认为是进展性疾病和部分缓解患者之间最显著的差异表达miRNA［56］。此外，基于外泌体的液体活检比组织活检具有更小的侵入性和更低的成本［57］。随着液体活检技术的发展，外泌体有可能成为免疫治疗的潜在生物标志物。

4 外泌体作为靶点在肺癌免疫治疗中的潜在作用

4.1 阻断外泌体上的免疫检查点

CD47 是一种免疫检查点，通常在肿瘤细胞上高表达，通过与吞噬细胞上的信号调节蛋白α（signal regulatory protein α， SIRPα）结合，抑制巨噬细胞的吞噬作用［58］。阻断CD47/SIRPα 相互作用已作为一种治疗策略，包括以CD47 或SIRPα 为靶点的单克隆抗体和拮抗相互作用的重组SIRPα 蛋白［59］。例如，Zhang 等［60］发现一种新的靶向CD47 的融合蛋白SIRPαD1-Fc 可以增加巨噬细胞对NSCLC 细胞的吞噬和细胞毒活性。然而使用重组SIRPα 蛋白虽然可以通过阻断抑制信号增强体外吞噬能力，但体内治疗效果只有与其他抗癌药物结合才能实现［61］。此外，Liu 等［62］在免疫缺陷小鼠肺癌细胞异种移植模型中发现抗CD47抗体可使巨噬细胞吞噬肺癌细胞，从而抑制肿瘤生长，提高荷瘤动物的生存。然而，有限的特异性导致抗CD47 抗体与正常（非肿瘤）细胞结合，导致贫血和白细胞减少。为了克服这些限制，Koh 等［63］开发了一种基于外泌体的免疫检查点阻断剂，即表面含有SIRPα 变异体的外泌体，显著提高了其对CD47 的亲和力。静脉注射SIRPα 变异体-外泌体后增强了巨噬细胞的肿瘤吞噬能力，引发了有效的抗肿瘤T 细胞反应，提示SIRPα 变异体-外泌体具有巨大的阻断免疫检查点的潜力。尽管这项研究基于结肠癌，但CD47 是所有肿瘤细胞的主要抗吞噬信号［59］。这为SIRPα 变异体-外泌体用于肺癌治疗提供了思路。

4.2 外泌体分泌抑制剂与免疫检查点抑制剂联合应用

外泌体PD-L1 结合抗PD-L1 单克隆抗体（mAbs）从而释放了肿瘤细胞的PD-L1，或外泌体PD-L1 直接与效应T 细胞上的PD-1 结合，抑制抗体的阻断作用，允许PD-L1 介导持续的免疫抑制反应［18］。Yang等［64］发现BALB/c 4T-1 荷瘤小鼠经外泌体分泌抑制剂GW4869 和抗PD-L1 单克隆抗体处理后，原代肿瘤负荷降幅最大，表明外泌体分泌抑制剂与免疫检查点抑制联合治疗显示出协同效应。另一方面，外泌体circUHRF1 可能导致抗PD-1 免疫治疗的耐药性。Li 等［65］证明敲除外泌体cirUHRFI 可导致抗PD-1 治疗的敏感性提高，并提高了总生存率。本研究团队前期研究发现低氧TDXs 通过miR-21/PTEN/PD-L1 调节轴增强MDSCs 对γδT 细胞的抑制作用。同时，在口腔鳞状细胞癌小鼠中，通过联合抑制外泌体miR-21 和免疫检查点PD-L1/PD-1 显著抑制了肿瘤细胞的增殖。由此可见，联合外泌体抑制剂与免疫检查点抑制剂是肺癌患者治疗的新方向。到目前，外泌体抑制剂主要通过靶向RAB27A 及SMase 实现［66］。尽管联合外泌体抑制剂与免疫检查点抑制剂在肺癌患者免疫治疗中具有巨大的潜能，但仍需进一步的研究。

4.3 外泌体作为肿瘤疫苗

研究表明树突状细胞来源的外泌体（dendritic cell-derived exosomes， DEXs）及TDXs 有可能开创肺癌疫苗研制的新时代。DEXs 携带MHC-肽复合物和共刺激分子，具有强大的抗原呈递作用［5］。本质上，外泌体在肿瘤免疫治疗中具有新型细胞游离疫苗的功能［67］。目前，DEXs 已经历经第一代及第二代的发展。第一代的临床试验开始于2005 年，该研究利用DEX 治疗晚期肺癌患者，结果只有30%的患者中效应T 细胞功能轻微增加［68］。而后为了改善DEXs 诱导的有限的T 细胞反应开发了第二代DEXs，使用LPS 或IFN-γ 促进DCs 成熟后，再从成熟DCs 中获得外泌体，增强了T 细胞的抗肿瘤活性［69］。但在一项II 期临床试验中，NSCLC 患者在一线化疗后接受了IFN-γ-DEX 治疗，患者无进展生存期为50%，未见显著的免疫反应性［70］。在体外和体内动物模型中，TDEs 也可诱导肿瘤特异性T 细胞反应。然而，单纯TDEs 不能诱导强的抗肿瘤活性，必须对其进行修饰。目前已有几项研究表明改进TDXs 后可增强抗肿瘤反应。例如，超抗原修饰的TDEs 可诱导更强的免疫原性反应；来源于表达 IL-18+TDEs，可增强细胞因子释放及DC 细胞成熟，从而可诱导更强的特异性细胞毒性反应［16］。但尚未有TDEs 进入临床试验阶段。由此看来，目前外泌体疫苗在肺癌免疫治疗的疗效不尽人意，原因可能是TME 中的T 细胞多处于功能障碍状态，由此引发的免疫反应较弱［71］。急需寻求一定的联合治疗方式来增强DEXs 或TDXs 对T 细胞的激活作用，提高肿瘤患者的免疫治疗效果。值得一提的是，Choo等［72］通过挤压方式获取M1 巨噬细胞的外泌体模拟纳米囊泡（exosome-mimetic nanovesicles derived from M1 macrophages，M1NVs），他们发现向荷瘤小鼠注射M1NVs 可抑制肿瘤生长，并且联合应用M1NVs及aPD-L1，比两者单独应用能更有效地抑制肿瘤生长，并进一步揭示MINVs 主要通过将M2 巨噬细胞复极化为M1 巨噬细胞发挥作用，上述结果提示外泌体类似物可作为一种潜在的新型肿瘤疫苗。

5 结 语

目前肺癌免疫治疗在晚期肺癌的治疗中占据着重要地位，但由于免疫抑制性TME 的作用，削弱了免疫治疗的疗效。免疫抑制性微环境的形成涉及多种机制，外泌体是近年来广受关注的机制之一。基于外泌体在肿瘤免疫逃逸中的作用及对外泌体的生物学特性方面的研究，开发靶向外泌体的肿瘤免疫治疗方案成为了研究热点。但目前外泌体是否可作为未来免疫治疗的生物标记物或作为癌症疫苗，均缺乏系统研究。癌症疫苗虽然已经进入临床试验，但目前未显示出良好的疗效，并且实验多基于小样本，癌症疫苗是否能使肺癌患者获益仍存在争议。此外，基于外泌体的其他癌症免疫治疗显示出了较好的疗效，但研究停留在动物模型阶段，这些治疗方案是否能使肺癌患者获益仍不清楚，需要开展更多实验研究来进一步推动外泌体在肺癌免疫治疗的临床应用和转化。

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