染色法构建对超临界CO2提取沙棘籽油的过程分析

周 雅, 周雪华, 谢雨波, 严晓阳, 王 芳,, 邓 刚

(浙江省特色经济植物生物技术研究重点实验室;浙江师范大学化学与生命科学学院1,金华 321004) (浙江师范大学行知学院理学院2,兰溪 321100)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)属胡颓子科沙棘属落叶灌木,截至2022年在我国种植总面积约为1.273×106hm2,约占世界沙棘种植总面积的55%[1]。成熟的沙棘果年产量为50～60万t,并且将以每年10%～20%的速度增长,其加工后约产生13.8万t的沙棘籽[2]。沙棘籽富含油脂,油脂质量分数为8%～20%[3],并且沙棘籽油具有抗氧化、抗菌、促进伤口愈合及抑制心血管疾病等多种生理活性[4],因而在医药、食品、日用化工等领域均有广泛应用[5-7]。

超临界CO2提取可以从沙棘籽中获取无污染、纯天然的沙棘籽油[8],相比于传统的提取工艺如机械压榨法[9]、溶剂提取法[10],该法避免了有机溶剂消耗、热降解和萃取时间长等弊端,确保了产品的质量,符合绿色发展趋势[11]。研究加压提取过程中物料内容物的分布及含量变化,进而构建油脂释放动力学,对深入了解提取机理、优化工艺及提高油脂品质等方面均有非常重要的意义。随着油脂染色技术、显微显影技术的迅猛发展[12-15],油脂的可视化显影可以识别并精准定量植物[14]、动物[16]、微生物[17]中的油脂。特别是Mehlem等[16]采用了油红O对肝细胞中的脂质进行了特异性染色,并构建了分析定量方法,用于病理研究,证实了油红O相比于其他特异性脂溶性染料,染色后观察到的脂滴边界更清晰,且无背景干扰[18,19]。此外,Lopez-ordaz等[14]用油红O染色法对天然蓖麻种子胚乳细胞进行了显影,证实了细胞内脂质体形变及脂质去除。然而,前期研究表明,常规ORO染色应用于显影粉碎干燥后果蔬籽料内油脂时,脂滴经常发生移位,且染色极易过染或不充分,无法满足对物料内脂滴可视化显影分析的需求。

研究分析ORO常规染色法用于显影干物料中沙棘籽油存在的一些问题,对一些关键步骤进行改进,新构建ORO逐级染色法,优化新方法的染色间隔时间,调整其染色级数和染液浓度,以获取最佳的籽油显影,创建相应的油脂定量方法,评价该方法的精密度和准确性,应用ORO逐级染色法直观地分析了超临界CO2提取沙棘籽油的过程。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙棘籽采购自甘肃省张掖市民乐县,于55 ℃鼓风干燥至恒重,经机械研磨后,过40目标准筛,选取粒径范围为400～500 μm的颗粒进行后续的研究,真空密封后置于-20 ℃避光储藏。

油红O染料(Biological Stain);CO2气体(纯度≥99.9%);Tissue-Tek OCT冷冻包埋剂;乙醚、异丙醇等均为分析纯。

油红O染液的配制:称取0.5 g油红O溶解于100 mL异丙醇中,配制成质量浓度5 mg/mL的油红O母液,使用体积分数60%异丙醇对油红O母液进行稀释,得到不同浓度的油红O工作液。

1.2 实验仪器

HELIX超临界天然产物萃取装置,CM1950冷冻切片机,BX53光学显微镜。

1.3 方法

1.3.1 ORO常规染色法和逐级染色法

ORO常规染色法:使用包埋剂对沙棘籽样品进行包埋,冷冻至-20 ℃,切片,厚度为25 μm。在切片上滴加20 μL 2 mg/mL ORO工作液,静置3 min后,倾斜去除染液,冲洗切片3次,加盖玻片进行显影观察。

ORO逐级染色法:在样品切片上,滴加10 μL 60%异丙醇,浸润1～2 min。然后滴加2 μL的ORO工作液进行第一级的滴染,间隔一定时间后显影,观察脂滴是否充分上染,重复染色步骤进行逐级染色,直至染色充分。

1.3.2 面积占比法的构建

面积占比法:使用Image J图像数据分析软件(v 1.51j)对ORO逐级染色后的显影图像进行处理,通过设定阈值,识别研究区域内的染色脂滴,读取脂滴的面积占比(AF)。由于冷冻切片厚度一致,沙棘籽物料内的油脂含量(SOF),可由公式计算得到:

式中:ρsample为沙棘籽切片密度1.06 g/cm3;ρoil为沙棘籽油密度0.934 g/cm3。

精密度和准确度评价:采用索氏提取法提取沙棘籽油,提取过程中随机取样,制备了5个未知油含量的样本。提取液经旋转蒸发脱除溶剂,得到沙棘籽油,采用传统萃取称重法计算油含量,重复3次取平均值。对各取样样本进行包埋、冷冻切片、ORO逐级染色后,采用面积占比法计算得到样本中的油含量。计算了2种方法测量结果的相对标准偏差(RSD),评价方法的重现性,并对2种方法进行了相关性分析,计算相关系数R值,评价新构建方法的准确性。

1.3.3 可视化微观显影超临界CO2提取沙棘籽油的过程

称取100 g沙棘籽粉末,与等体积玻璃珠混合,置于萃取釜,在压力为30 MPa,温度为45 ℃及CO2流速为5 L/h的条件下,进行超临界CO2萃取沙棘籽油,萃取时间为5 h,每隔0.5 h对物料进行取样,经ORO逐级染色后显影观察,使用面积占比法计算油含量,绘制了沙棘籽油的提取得率曲线,通过计算获得提取速率曲线。

2 结果与分析

2.1 ORO常规染色法显影干物料存在的问题

ORO常规染色方法显影干物料存在的问题如图1所示。

新鲜的沙棘籽内部的油脂通常以封闭囊泡的形式束缚于细胞中,但经干燥粉碎后的籽料是一种开放体系,脂滴以游离形式存在于微腔中,采用ORO常规染色法对其染色时,会出现一些问题。当物料中的油含量较高,所用染液的染料浓度偏低,则脂滴会发生染色不充分而呈现黄色(图1a),后继的洗脱步骤在洗去多余染料的同时,也会带走少量与脂滴结合的染料。此外,如果染色时间过短,脂滴无法完全和染料融合,也可能发生染色不充分。当物料中的油含量较低时,所用的染料浓度偏高,则会导致脂滴过染(图1b),期间如果染色时间过长,染液中的溶剂挥发,ORO染料将会发生结晶,造成染料板结现象(图1c)。特别要指出的是,常规方法的一次性滴加染液的方式及洗脱步骤均会造成脂滴迁移(图1d)、脂滴损失(图1e)等现象。由此可知,ORO常规染色法很难客观地显影样品中的沙棘籽油,因而无法满足含油物料加工及提取过程中样本监测的要求。

2.2 ORO逐级染色法的染色间隔时间优化

ORO逐级染色法是在样本切片表面分多次滴加微量的染液,以保持物料始终处于浸润状态,利于染液对脂滴进行均匀上色,直至染色充分。每次滴加染液后,染料分子在微湿的微环境中扩散,再与脂滴进行结合而显色,因而染色间隔时间对显影的影响较大。分别采用不同染色间隔时间对籽油进行显影,ORO逐级染色间隔时间的优化如图2所示。当染色间隔时间为1 min时,由于染色间隔时间过短,ORO染料在切片内扩散不充分,导致脂滴不能均匀上色,并且多数脂滴未被充分染色(图2a)。当染色间隔时间为3 min时,由于染色间隔时间过长,切片内部的溶剂逐渐挥发,染料分子向周边扩散,脂滴呈现不规则的形态(图2c)。最终选择的适合的染色间隔时间为1.5 min,在此条件下沙棘籽切片中的脂滴可被充分染色而呈现、明亮的红色(图2b)。

2.3 ORO逐级染色法中染色级数和染液浓度的调整

ORO逐级染色沙棘籽油显影过程如图3所示,以相同油含量的同批次物料为例,期间调整染液浓度和染液级数,直至脂滴均匀充分上色。图3a列中使用了1 mg/mL低质量浓度染液,在一、二级中脂滴染色不充分,第三级中脂滴充分染色,而第四级物料中脂滴已过染;图3b列增大染液质量浓度至2 mg/mL后,在一级中脂滴染色不充分,而第三级中脂滴轻度过染,表明此条件下二级染色中脂滴充分染色;使用更高质量浓度3 mg/mL的染液进行滴染,如图3c列所示,一、二级中脂滴已过染,由此表明使用的ORO染液浓度不宜过高,可针对不同含油量样本调整染液浓度,少量多次的滴加染液,从而找到染色充分的级数。ORO逐级染色过程中,每一级微量的染液能被样本吸收,能使切片始终处于半浸润状态,与常规染色法相比,不会有染液溢出,也无需洗脱步骤,可真实客观地呈现干物料中的脂质分布,从而满足了籽油提取过程中的可视化分析需求。

图3 ORO逐级染色沙棘籽油显影过程 (标尺100 μm)

2.4 沙棘籽油面积占比定量法的构建

ORO逐级染色法可对未知油含量样本中的脂滴进行充分染色,并且客观显影其在物料中的分布,基于该方法进一步构建了定量沙棘籽油的面积占比法,并与传统萃取质量法进行了对比评测分析。分别使用2种方法测定了5个随机样本中的油含量,计算了RSD,面积占比法和萃取质量法的对比评价分析如图4所示,面积占比法的平均标准偏差约为2.49%,略低于萃取质量法的2.74%,说明面积占比法测定油脂含量的重现性更好。然后对2种方法测定结果进行了线性相关性分析,得到2组数据的相关系数高达0.998,呈现严格的正相关,表明新构建的面积占比法的准确性与传统萃取质量法相当,能准确测定沙棘籽物料内部的油含量。

图4 面积占比法和萃取质量法的对比评价分析

2.5 ORO逐级染色法对超临界CO2提取沙棘籽油的过程分析

在压力为30 MPa、温度为45 ℃的条件下进行超临界CO2萃取沙棘籽油,采用面积占比法绘制提取过程曲线(图5),并计算了该曲线各点的斜率,得到了相应的提取速率曲线,超临界CO2提取沙棘籽油的过程分析如图6所示。提取曲线呈现典型的三阶段过程[20]:1) 恒速提取期(CER,0～1 h);2) 减速提取期(FER,1～4 h);3) 扩散提取期(DC,4～5 h)。对各阶段的物料进行取样,经ORO逐级染色法进行染色显影分析。图6a表明,物料提取前沙棘籽油密集分布于微腔内,脂滴呈球形,直径约为5 μm,SOF值接近13.1%;在CER期(图6b),附着在籽料颗粒内表面的沙棘籽油极易被提取,SOF值迅速下降至3.61%,相应的油得率约为9.5%,约占总油脂得率的73.0%,并且油脂以恒定的速率释放至超临界流体中;进入FER期后,由图6c和图6d可知,籽料颗粒内仅有少量脂滴残留,且脂滴直径明显变小,SOF值从2.77%缓慢下降至1.48%,油得率约为11.6%,油提取速率则由恒速期的100 mg/h下降至39 mg/h,该阶段仍受对流传质控制,并且颗料内的易提取油已基本提取殆尽;在DC期(图6e),只有极少量脂滴以结合态的形式残留于微腔内部,SOF值仅为1.48%,最终油得率为13.1%,该阶段主要受扩散传质控制,相应的油提取速率均小于30 mg/h,这一结果与Han等[21]对红花籽油提取动力学研究相一致。通过新方法对超临界CO2提取沙棘籽油的动态释放过程进行了综合分析,可用于阐明加压流体在各个不同阶段的提取作用机制,利于更精准地获取最优的操作条件,提高原料的利用率及有效地降低提取成本。

图5 沙棘籽油的提取过程

图6 超临界CO2提取沙棘籽油的过程分析(标尺100 μm)

3 结论

针对ORO常规染色法中出现的脂滴迁移、染色不充分等问题,构建了ORO逐级染色法,通过控制染料浓度及染色级数,可客观地显影脂滴在物料中的分布,基于此进一步构建了相应的油脂定量方法。采用新染色方法直观分析了超临界CO2提取沙棘籽油的CER、FER和DC三阶段提取过程,可作为一种研究复杂流体提取动力学有效的辅助手段。ORO逐级染色法可有效地监测加工处理过程中籽油在物料内部的分布及迁移,实时观测其含量变化,为籽料为油的提取理论研究及实际生产加工提供可靠的影像学参考。