L-阿拉伯糖对锯谷盗成虫毒杀作用及其过冷却点和冰点的影响

卢少华, 刘嘉澍, 王争艳, 鲁玉杰, 2

(河南工业大学粮食和物资储备学院1,郑州 450001) (江苏科技大学粮食学院2,镇江 212100)

作为产粮大国,我国的粮食总产量已连续7年保持在1.3万亿斤以上[1]。原粮及成品粮储备安全不仅是粮食安全体系的基础,更是食品安全体系中至关重要的组成部分[2]。国家粮食和物资储备局的统计数据显示,我国粮食在储藏、运输和加工等产后环节损失量惊人,每年损失在700亿斤以上[3]。而虫霉为害是导致粮食产生损耗的主要原因之一,也是粮食仓储保管工作中必须解决的问题。锯谷盗Oryzaephilussurinamensis属鞘翅目Coleoptera,锯谷盗科Silvanidae,是一种重要的储藏物害虫,其适应能力强,繁殖速度快,常发生于粮仓和食品加工厂中,可为害粮食、油料、中草药、干果等多种储藏物[4, 5]。由于产品的特殊性和害虫发生环境的复杂性,传统的化学药剂防治储藏物害虫面临的挑战越来越严峻,寻找安全、高效、绿色的储藏物害虫防治技术已迫在眉睫。

L-阿拉伯糖又称为果胶糖、树胶全糖,是一种天然的低热量单糖,食品中常作为蔗糖的代糖[6]。其外观与蔗糖相似,甜度是蔗糖甜度的二分之一,但被动物摄入后基本不产生热量,不参与动物的代谢[7]。已有研究表明,L-阿拉伯糖具有引诱昆虫取食的作用。例如通过分析埃及伊蚊Aedesaegypti、地中海粉螟Ephestiakuehniella对多种碳水化合物糖餐的选择行为,发现两者对含有阿拉伯糖的糖餐具有明显的取食偏好性[8,9]。在研究野螟亚科昆虫Uresiphitagilvata的幼虫取食偏好性中发现,人工饲料中被消耗最多的碳水化合物是阿拉伯糖[10]。然而L-阿拉伯糖对昆虫的生长发育是不利的,甚至对昆虫具有毒杀作用。例如B型烟粉虱Bemisiatabaci取食添加质量分数10%L-阿拉伯糖的人工饲料后,3龄若虫停止发育,不再蜕皮[11]。而用添加质量分数5%、10%L-阿拉伯糖的人工饲料饲喂烟粉虱后,B型和Q型烟粉虱成虫的死亡率均显著高于对照组[12, 13]。随着人工饲料中L-阿拉伯糖的质量分数增加,棉铃虫幼虫的生育期逐渐延长,幼虫和蛹的体型变小[14]。而在由蔗糖和硼酸组成的胰酪大豆胨液体培养基(TSB)中添加L-阿拉伯糖也会降低埃及伊蚊的存活率[8]。由此可见,L-阿拉伯糖对哺乳动物无害,但对昆虫却有一定的毒杀作用。

糖是维持昆虫生命活动的重要能量来源,也是刺激昆虫取食的重要信号物质之一。L-阿拉伯糖广泛存在于粗粮皮壳、水果中,通过抑制昆虫肠道内蔗糖酶的活性,从而抑制昆虫对蔗糖的吸收和代谢[15]。L-阿拉伯糖对人畜无害,作为减肥药和食品添加剂已被大众广泛接受。而作为一种具有应用潜力的绿色杀虫剂,L-阿拉伯糖对储藏物害虫的影响鲜有研究报道。因此,本研究拟通过比较L-阿拉伯糖对锯谷盗存活率、抗氧化酶活性、过冷却点和冰点的影响,探索利用L-阿拉伯糖防治储藏物害虫的可行性和可靠性,为利用L-阿拉伯糖对储藏物害虫进行安全绿色防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试昆虫:锯谷盗O.surinamensis于河南工业大学储藏物昆虫实验室以全麦粉标准化饲养了数十代,饲养条件为:温度29～31 ℃,湿度70%～80%,光周期L∶D=24∶0。随机选取新羽化3 d内的锯谷盗成虫用于实验。

试剂及仪器:L-阿拉伯糖,谷胱甘肽S-转移酶(GST)试剂盒,过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒。酶标仪,SUN-V型智能昆虫过冷却点测定仪,全自动样品快速研磨仪,5430R冷冻高速离心机,GSP-9160MBE型隔水式恒温培养箱。

1.2 实验方法

1.2.1 人工饲料的制备

取0.5 gL-阿拉伯糖溶解于适量无菌水中,与9.5 g灭菌的全麦粉充分混匀后,置于50 ℃烘箱中烘干,后用研钵将其粉碎研磨,得到含质量分数5%L-阿拉伯糖的人工饲料。用此方法配成含质量分数2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%L-阿拉伯糖的人工饲料。

1.2.2 锯谷盗的死亡率测定

分别取含不同质量分数L-阿拉伯糖(5%、10%、15%、20%)的人工饲料和不添加L-阿拉伯糖的全麦粉各1 g,放入涂有聚四氟乙烯的养虫盒内,不同糖含量处理重复6次。每个养虫盒内放入随机挑选新羽化3 d内的锯谷盗成虫50头。观察记录取食72 h后的锯谷盗成虫存活情况,计算锯谷盗的校正死亡率。

1.2.3 锯谷盗的酶活性变化测定

将1.2.2中存活的试虫分组收集到灭菌后的1.5 mL离心管中,各酶活测定分别随机选用同等条件处理的3组试虫进行,并用无菌水洗涤数次,然后加入试剂盒中的缓冲溶液,并将离心管置于预冷过的样品快速研磨仪中将试虫粉碎,后8 000 g离心10 min,置于冰上待测。将酶标仪预热30 min以上后,调节波长至240 nm测定CAT活性,340 nm测定GST活性,并在测定前使用蒸馏水调零,并将酶活性检测工作液置于25 ℃水浴10 min以上。在96孔UV板上依次加入样本液及工作液,按照试剂盒说明书要求记录不同时间的吸光值,计算相应的酶活性。检测酶活性时每个重复进行5次检测,以保证实验数据的可靠性。CAT活性单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化1 μmol H2O2降解定义为1个酶活性单位;GST活性单位的定义:在25 ℃中,每g样本每分钟催化1 μmol CDNB与GSH结合为一个酶活性单位。

1.2.4 过冷却点、冰点变化的测定

分别取含不同质量分数L-阿拉伯糖(2%、4%、6%、8%、10%)的人工饲料和不添加L-阿拉伯糖的全麦粉各1 g,放入涂有聚四氟乙烯的养虫盒内,不同糖含量处理重复3次。每个养虫盒内放入随机挑选新羽化3 d内的锯谷盗成虫50头放入养虫盒内。随机选取取食72 h的锯谷盗活成虫30头测定过冷却点和冰点。测定方法参考段云等[16]和张悦等[17]的方法,采用智能昆虫过冷却点测定仪(SUN-V型)及配套软件测定过冷却点和冰点。测定时先将待测虫体放置在离心管内,将热敏探头导线塞进离心管,用少量脱脂棉固定,使热敏探头紧贴虫体,置于低温冰箱中,通过热敏电阻元件跟踪记录虫体的温度变化,用计算机及其配套软件进行记录和分析,绘制虫体温度变化曲线,确定过冷却点和冰点。待测虫体温度下降后突然回升的拐点温度即是该试虫的过冷却点,随着待测虫体温度上升而出现下降趋势的拐点温度为该试虫的冰点。

1.3 数据处理

使用SPSS20.0软件进行数据统计分析。首先检测数据方差齐性和正态性,不符合正态分布的数据进行平方根反正弦转换。采用单因素方差分析(One Way ANOVA)评价锯谷盗的死亡率、CAT活性、GST活性、过冷却点和冰点,当方差差异显著时再用Duncan’s新复极差法对平均值进行多重比较。差异性显著水平设置为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 L-阿拉伯糖对锯谷盗成虫死亡率的影响

通过对锯谷盗饲喂不同质量分数L-阿拉伯糖的人工饲料发现,低质量分数的L-阿拉伯糖(5%、10%)对锯谷盗的死亡率没有显著的影响,校正死亡率分别为3.46%、6.56%。而随着饲料中L-阿拉伯糖质量分数的增大,锯谷盗的死亡率也越来越高,锯谷盗取食质量分数为15%和20%L-阿拉伯糖的人工饲料后,锯谷盗成虫的校正死亡率分别为21.04%、39.66%,显著高于对照组和低L-阿拉伯糖浓度处理组,比对照组的死亡率分别提高了17.71%、36.33%。含高质量分数的L-阿拉伯糖饲料能显著提高锯谷盗的死亡率。

已有的研究表明L-阿拉伯糖能够抑制动物体内蔗糖代谢相关酶类的活性,而使动物体内没有充足可供吸收的葡萄糖或果糖,进而对其生长发育产生了一定的影响[7, 18, 19]。目前,L-阿拉伯糖在食品和药品等行业中被大量使用,具有降低血糖、改善肠道功能与肠道菌群的作用[20]。已有研究表明L-阿拉伯糖是埃及伊蚊[7]、地中海粉螟[9]、野螟亚科昆虫Uresiphitagilvata[10]等的引诱剂或激食剂;但对于取食次数较少的烟粉虱[12, 13]、棉铃虫Helicoverpaarmigera、烟草夜蛾Helicoverpaassulta、黑胸散白蚁Reticulitermeschinensis[15],L-阿拉伯糖可能被认为是一种拒食剂。而无论是作为引诱剂、激食剂或拒食剂,L-阿拉伯糖对某些昆虫的确具有潜在的抑制发育或杀虫作用。Sun等[15]报道了L-阿拉伯糖可以抑制棉铃虫幼虫的摄食和肠道蔗糖酶的活性,这直接导致昆虫生长发育所需能量的不足,从而导致昆虫生长发育历期延长、蛹重减轻、羽化率降低、死亡率升高等不良影响。通过比较L-阿拉伯糖对锯谷盗存活率的影响发现,高质量分数的L-阿拉伯糖直接导致锯谷盗的死亡率显著增加,说明了L-阿拉伯糖对锯谷盗成虫的确具有致死作用。并且已有研究证明较低质量分数的L-阿拉伯糖就能降低埃及伊蚊的存活率[8],而5%以上的L-阿拉伯糖可以造成B型和Q型烟粉虱种群100%的死亡[11, 12]。昆虫种类、个体大小、取食方式和生活环境的不同,可能是导致L-阿拉伯糖杀虫效果不同的原因。

注:图中数据为平均数±标准误。不同字母表示差异显著(ANOVA,Duncan检验,P<0.05)。

2.2 L-阿拉伯糖对锯谷盗成虫CAT、GST活性的影响

如表1所示,通过测定取食含不同质量分数L-阿拉伯糖饲料的锯谷盗抗氧化酶活性发现,锯谷盗取食质量分数10%、15%、20%L-阿拉伯糖的人工饲料后,体内的CAT活性均显著升高(P<0.05),并且在取食15%L-阿拉伯糖的饲料后,试虫的CAT活性最高,约是对照组的2倍,并且显著高于质量分数10%、20%L-阿拉伯糖处理组的CAT活性(P<0.05)。而锯谷盗取食含有不同质量分数的L-阿拉伯糖的人工饲料后,体内的解毒酶GST活性均显著降低(P<0.05),并且随着饲料中L-阿拉伯糖质量分数的增大,GST活性逐步降低,GST活性在L-阿拉伯糖质量分数为20%时最低(P<0.05),约为对照组的1/2。

表1 饲喂不同质量分数L-阿拉伯糖后锯谷盗过冷却点和冰点的变化

注:图中数据为平均数±标准误。不同大写字母表示CAT活性差异显著性,不同小写字母表示GST活性差异显著性(ANOVA,Duncan检验,P<0.05)。

L-阿拉伯糖通过抑制昆虫体内海藻糖酶、麦芽糖酶和淀粉酶活性,导致昆虫体内能源物质和营养物质无法得到正常的供给,对昆虫的生长发育产生严重的不利影响[15]。而昆虫体内的保护酶和解毒酶活性的变化与昆虫所受外界刺激的强度密切相关,能够反映昆虫对某些药剂的耐药性或对不良环境的适应性。过氧化氢酶(CAT)是生物体内在抗氧化和细胞损伤等方面起着重要作用的保护酶,广泛存在于昆虫体内[21]。谷胱甘肽-S-转移酶(GST)可以促使昆虫体内还原型谷胱甘肽(GSH)和外来毒性化合物反应,产生更容易溶解的可排泄化合物排出体外,是昆虫体内重要的解毒酶[22-24]。杀虫剂能够导致昆虫体内CAT活性上升和GST活性下降,例如随着吡虫啉浓度的增加,赤子爱胜蚓Eiseniafetida的CAT活性逐步升高[25];随着蓖麻碱处理浓度的增加,甜菜夜蛾Spodpteraexigua幼虫体内GST活性逐步下降[26];随着八角茴香提取物施用的剂量升高,玉米象Sitophiluszeamais体内的GST活性受到的抑制作用就越大[27]。而随着人工饲料中L-阿拉伯糖质量分数的增加,锯谷盗体内的CAT活性增大,而GST活性降低,说明L-阿拉伯糖对储藏物昆虫的抗氧化酶活性有显著影响。

2.3 L-阿拉伯糖对锯谷盗成虫过冷却点和冰点的影响

如表1所示,通过测定取食不同质量分数L-阿拉伯糖人工饲料锯谷盗的过冷却点和冰点发现,锯谷盗成虫体液的过冷却点和冰点温度均显著性提高。随着饲料中L-阿拉伯糖质量分数的增大,锯谷盗成虫体液的过冷却点逐步升高,在饲料中L-阿拉伯糖质量分数为8%时,锯谷盗成虫体液的过冷却点升高最大且显著高于其他处理组,比对照组升高了3.83 ℃(P<0.05)。锯谷盗成虫体液的冰点随着饲料中L-阿拉伯糖质量分数的增大而上升,在饲料中L-阿拉伯糖质量分数为8%时,锯谷盗成虫体液的冰点较其他处理组显著升高,比对照组升高了3.43 ℃(P<0.05)。

过冷却点和冰点是衡量昆虫耐寒性的重要指标,过冷却点和冰点越高的昆虫对低温的适应能力越差[28]。过冷却点和冰点会受环境、发育阶段、营养等多种因素的影响[29]。L-阿拉伯糖提高锯谷盗的过冷却点和冰点,可能是其抑制了锯谷盗利用海藻糖、麦芽糖和淀粉的正常代谢,体内能源物质和营养物质无法得到正常的供给,进而导致耐低温能力降低。

3 结论

随着人工饲料中L-阿拉伯糖质量分数的增大,锯谷盗成虫的死亡率逐步增大,低质量分数的L-阿拉伯糖(5%、10%)对锯谷盗的死亡率没有显著的影响,而高质量分数的L-阿拉伯糖(15%、20%)直接导致锯谷盗的死亡率显著增加,说明L-阿拉伯糖对锯谷盗成虫的确具有一定致死作用。并且L-阿拉伯糖显著影响了锯谷盗的抗氧化酶CAT和解毒酶GST的活性,这2种酶对昆虫抗逆境胁迫和解毒至关重要,L-阿拉伯糖对锯谷盗具有一定的毒杀作用。锯谷盗取食含L-阿拉伯糖的饲料后,过冷却点和冰点均有明显上升,降低了锯谷盗对低温的抵抗能力。总的来说,L-阿拉伯糖对锯谷盗具有防治效果,是一种有应用前景的储藏物害虫杀虫剂的替代品。