微RNA-223在慢性阻塞性肺疾病血清外泌体中的表达

任明慧

作者单位：济宁市第一人民医院老年医学科，山东 济宁272000

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常见的呼吸系统疾病，主要表现为咳嗽、咳痰、气促、喘息、胸闷、疲乏等症状，有慢性致残、反复发作的特点，且肺功能不可逆转，严重时可发展为肺心病与呼吸衰竭，给病人身心健康带来很大影响［1-2］。因此，对COPD病人早期诊断、判断病情具有重要意义。外泌体（exosomes）是细胞外囊泡，可携带多种蛋白质、脂类和核酸，可在细胞间进行信息传递，在免疫反应、炎症反应等过程中发挥重要作用［3］。微RNA（microRNA，miRNA）有多种生理学功能，可参与COPD、肺结核、哮喘、肺癌等肺部疾病的发病过程［4］。miRNA-223在先天免疫、炎症反应等多种生理病理过程中具有关键作用，与多种炎症性疾病有关［5］。在肺结核大鼠中，过表达miR-223可抑制STAT3信号通路增强肺泡巨噬细胞的吞噬能力［6］。miRNA-223在COPD病人肺组织、COPD小鼠模型中miR-223的表达水平升高，体外实验显示，在肺动脉内皮细胞中miR-223靶向组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）调控趋化因子水平，参与COPD的炎症反应［7］。以上表明，miRNA-223在肺部疾病中发挥重要作用，miRNA-223在COPD病人血清外泌体中的研究尚未见报道，本研究检测COPD病人血清外泌体中miRNA-223表达情况，探讨miRNA-223表达与COPD疾病严重程度相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年3月至2021年6月在济宁市第一人民医院呼吸科治疗的稳定期COPD病人113例作为观察对象（COPD组），其中男67例，女46例，年龄范围为38～74岁，年龄（57.20±11.50）岁。根据肺功能将COPD病人分为轻度组40例、中度组31例、重度组25例和极重度组17例。纳入标准：（1）符合2013年中华医学会呼吸病学分会COPD诊断标准［8］；（2）病人临床资料完整；（3）病人近期未使用相关药物进行治疗。排除标准：（1）急性肺栓塞、肺结核、哮喘、肺癌等其他呼吸系统疾病的病人；（2）合并肝肾功能不全、类风湿关节炎等自身免疫系统疾病及其他系统炎症性疾病病人；（3）合并高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病病人；（4）合并其他肿瘤病人；（5）孕妇或产妇；（6）痴呆、认知功能障碍的病人。

另选取同期在济宁市第一人民医院体检的100例健康体检人员作为对照组，其中男59例，女41例，年龄范围为40～76岁，年龄（56.80±11.30）岁。两组男女比例（P=0.965）、年龄（t=0.26，P=0.799）比较，差异无统计学意义，具可比性。

本研究中病人或其近亲属知情同意，并签署知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 主要试剂与仪器 人C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）（EK194）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）（EK182）、白细胞介素-6（IL-6）（EK106）检测试剂盒购自联科生物科技有限公司，兔抗人CD63、CD9、TSG101多克隆抗体购自Elabsceience公司，Trizol试剂、外泌体提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT reagent kit）、miScript SYBR Green PCR Kit购自Takara公司。PowerCyclerPCR仪购自德国Analytikjena公司，JEM-2100透射电子显微镜购自日本JEOL公司，P800型全自动生化分析仪购自罗氏公司。

1.3 研究方法

1.3.1 血清外泌体的提取与鉴定 分别采集COPD病人和健康体检人员空腹内静脉血5 mL，室温下以3 000g离心30 min，然后再以16 000g离心15 min，分离血清，置于-80 ℃冰箱保存。采用外泌体提取试剂盒提取血清中外泌体，按照试剂盒操作说明书进行操作，电镜观察外泌体形态，采用蛋白质印迹法鉴定外泌体表面蛋白CD63及CD9。

1.3.2 血清外泌体miRNA-223水平检测 采用RT-qPCR检测血清外泌体miRNA-223相对表达量。Trizol试剂提取血清外泌体总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA后，进行RT-qPCR扩增。反应条件：95 ℃预变性600 s；95 ℃变性75 s，65 ℃退火60 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。miRNA-223正向引物序列（5′-3′）：CGTGTATTTGACAAGCTG，反向引物序列（5′-3′）：GAACATGTCTGCGTATCTC；U6正向引物序列（5′-3′）：CTCGCTTCGGCAGCACAT，反向引物序列（5′-3′）：TTTGCGTGTCATCCTTGCG。以对照组人员血清为对照，校正每个样本外泌体数量，以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算外泌体miRNA-223相对表达量。

1.3.3 肺功能指标及炎性因子水平检测 肺功能指标：对所有观察者进行肺功能检测，采用肺功能检测仪检测静息状态下第1秒用力呼气容积（forced expiratory volume in 1 second，FEV1）、FEV1占预计值百分比（FEV1%pred）、FEV1占用力肺活量（forced vital capacity，FVC）百分比（FEV1/FVC）。

采用酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测血清炎性因子CRP、TNF-α、IL-6水平，检测下限分别为0.44 ng/L、0.42 ng/L、0.37 ng/L，具体操作参照其试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法 利用SPSS 17.0进行统计学分析。计量资料符合正态分布，以表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；采用Pearson分析COPD病人血清外泌体miRNA-223与TNF-α、IL-6、CRP、FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC相关性。若P＜0.05，表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COPD组与对照组肺功能指标比较 COPD组病人肺功能指标FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC显著低于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 COPD组与对照组肺功能指标比较/

表1 COPD组与对照组肺功能指标比较/

注：FEV1为第1秒用力呼气容积，FEV1%pred为FEV1占预计值百分比，FEV1/FVC为FEV1占用力肺活量百分比。

FEV1/L 2.83±0.44 1.77±0.62 14.22＜0.001组别对照组COPD组t值P值例数100 113 FEV1%pred 101.87±12.45 62.05±11.38 24.38＜0.001 FEV1/FVC/%86.47±8.08 64.01±11.52 16.27＜0.001

2.2 血清外泌体提取与鉴定 电镜下结果显示，血清外泌体为圆形或椭圆形囊泡状结构，直径约100 nm；蛋白质印迹法结果显示，对照组与COPD组外泌体均表达特异性蛋白CD63、CD9、TSG101，见图1。说明成功提取血清外泌体，可用于后续实验。

图1 血清外泌体的鉴定：A为电镜下显示外泌体为圆形或椭圆形囊泡状结构，直径约100 nm；B为对照组与COPD组外泌体CD63、CD9、TSG101蛋白表达

2.3 COPD组与对照组血清外泌体miRNA-223表达及炎性因子水平比较 与对照组比较，COPD组病人血清外泌体miRNA-223、TNF-α、IL-6、CRP水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 COPD组与对照组血清外泌体miRNA-223表达及炎性因子水平比较/

表2 COPD组与对照组血清外泌体miRNA-223表达及炎性因子水平比较/

注：COPD为慢性阻塞性肺疾病，miRNA-223为微RNA-223，TNF-α为肿瘤坏死因子α，IL-6为白细胞介素6，CRP为C-反应蛋白。

CRP/（mg/L）1.35±0.47 6.72±1.21 41.68＜0.001组别对照组COPD组t值P值例数100 113 miRNA-223 1.01±0.12 3.05±0.47 42.19＜0.001 TNF-α/（ng/L）2.83±0.81 5.23±1.14 17.50＜0.001 IL-6/（ng/L）2.47±0.58 5.43±1.05 25.01＜0.001

2.4 不同严重程度COPD病人血清外泌体miRNA-223水平及炎性因子比较 结果显示，轻度、中度、重度、极重度COPD病人血清外泌体miRNA-223表达水平依次升高，组内两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）；重度、极重度COPD病人血清TNF-α、IL-6、CRP水平显著高于轻、中度病人（P＜0.05），轻度与中度、重度与极重度COPD病人之间血清TNF-α、IL-6、CRP水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 不同严重程度COPD病人血清外泌体miRNA-223水平比较/

表3 不同严重程度COPD病人血清外泌体miRNA-223水平比较/

注：miRNA-223为微RNA-223，TNF-α为肿瘤坏死因子α，IL-6为白细胞介素-6，CRP为C反应蛋白。①与轻度组比较，P＜0.05。②与中度组比较，P＜0.05。③与重度组比较，P＜0.05。

组别轻度组中度组重度组极重度组F值P值CRP/（mg/L）6.20±1.05 6.45±1.21 7.16±0.95①②7.78±1.13①②10.42＜0.001例数40 31 25 17 miRNA-223 2.62±0.25 2.89±0.32①3.21±0.39①②3.52±0.40①②③36.18＜0.001 TNF-α/（ng/L）4.83±0.81 5.12±0.92 5.62±0.85①②5.75±0.91①②6.76＜0.001 IL-6/（ng/L）4.89±0.88 5.25±0.82 5.87±0.91①②6.44±0.93①②15.16＜0.001

2.5 COPD病人血清外泌体miRNA-223与炎性因子及肺功能指标相关性 相关性分析显示，COPD病人血清外泌体miRNA-223水平与TNF-α、IL-6、CRP水平呈正相关，与FEV1%pred 、FEV1、FEV1/FVC呈负相关（均P＜0.05），见表4。

表4 COPD病人血清外泌体miRNA-223与炎性因子及肺功能指标相关性分析结果

3 讨论

COPD主要为各种因素引起的肺部持续性的异常慢性炎症反应，其中TNF-α、IL-6、CRP为炎性因子，是评价COPD病人病情及炎症程度的标志物［9］；FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC是判断肺功能的重要指标，可用于评价COPD病人病情严重程度［10］。本研究结果显示，COPD组病人TNF-α、IL-6、CRP水平显著高于对照组，肺功能指标FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC显著低于对照组，提示COPD病人体内存在炎症反应和肺功能损伤。

外泌体是一种直径40～100 nm的囊泡，内含包括蛋白质、脂质、miRNA等分子结构，外泌体及其miRNA在肺癌、肺纤维化、哮喘、肺损伤等肺部疾病的发生发展中发挥重要作用，成为疾病诊断与治疗的标志物［11-12］。研究显示，多种外泌体miRNA与COPD疾病相关，如谢羽飞等［13］研究表明，COPD病人血清外泌体中miRNA-186相对表达量明显高于正常对照组，且其与COPD病人的FEV1%预计值呈负相关。miRNA-223为miRNA的一种，与多种炎症性疾病有关，Neudecker等［14］研究显示，在急性肺损伤小鼠模型中，miR-223从中性粒细胞到肺上皮细胞的细胞间转移可能通过抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP-1）来抑制急性肺损伤。另有研究显示［15］，哮喘病人中miRNA-223水平升高，且与FEV1、FEV1/FVC比值呈负相关。本研究结果表明，COPD组病人血清外泌体miRNA-223水平显著高于对照组，提示miRNA-223与COPD病人发病有关；且在轻度、中度、重度、极重度COPD病人中血清外泌体miRNA-223表达水平依次升高，提示miRNA-223与COPD病人病情的严重程度有关。研究显示［16］，miRNA-223可通过抑制TLR4/NF-KB信号通路并抑制NLRP3炎症小体的活化，减轻甲型流感病毒诱导的肺上皮细胞的炎症反应。推测miRNA-223可能通过参与调控炎症反应参与COPD的发生发展。

COPD的具体发病机制复杂，其主要特征为炎性反应、气道重塑、气流受限和肺功能下降。研究显示［17］，COPD病人急性期IL-6、CRP水平高于稳定期，且COPD急性加重期IL-6、CRP水平更高，表明炎性因子与COPD病人病情有关。本研究结果显示，重度、极重度COPD病人血清TNF-α、IL-6、CRP水平显著高于轻、中度病人，轻度与中度、重度与极重度COPD病人之间血清TNF-α、IL-6、CRP水平差异不显著，在多数炎症性疾病中，炎性因子均有升高，提示TNF-α、IL-6、CRP水平可反映COPD的炎症状态，不能反映COPD疾病严重程度。相关性分析显示，COPD病人血清外泌体miRNA-223水平与TNF-α、IL-6、CRP水平呈正相关，表明miRNA-223可能通过炎症反应参与COPD的发病过程，COPD病人TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子水平增加，可能与NF-κB等炎症相关信号通路有关。NF-κB的激活可诱导多种促炎基因的表达和炎症小体的激活，研究显示，miR-223在培养的人支气管上皮细胞（HBECs）中表达，下调miR-223可导致NF-κB信号激活［17］。且多数报道显示，miR-223主要发挥抗炎的作用，下调miR-223的表达可增加炎症反应，过表达miR-223可抑制促炎因子的释放［18］。而本文中COPD病人血清外泌体中miRNA-223水平虽升高，但不足以降低TNF-α、IL-6等炎性因子的释放，此外，miR-223的大多数靶基因在COPD中升高，可能是由于肺局部组织腔室的改变，miR-223的保护作用受损或不足以降低哮喘和COPD中的高炎症反应。本研究还发现COPD病人血清外泌体miRNA-223水平与FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC呈负相关，进一步证实miRNA-223与COPD病人病情的严重程度有关，血清外泌体miRNA-223水平可反映COPD病人肺功能情况，其可能作为预测COPD发生及其病情严重程度的标志物之一。本研究仅分析COPD病人血清外泌体miRNA-223水平与炎性因子及肺功能的相关性，miRNA-223在COPD中的具体作用机制仍需结合动物模型做更深入的研究。

综上所述，miRNA-223在COPD病人血清外泌体中表达水平升高，与病人疾病严重程度有关，可能作为判断COPD病情严重程度的潜在标志物，为临床COPD诊治提供一定参考，但其具体作用机制仍需做进一步研究。